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1、液相色谱液相色谱质谱联用的质谱联用的原理及应用原理及应用 中心实验室1医学参考A简介简介 n色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。n色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。 2医学参考A液质联用与气质联用的区别: n气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。 n液质联用(LC-MS)主要可解决
2、如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。 3医学参考ANeutralNeutral10101 110102 210103 310104 410105 5Molecular WeightMolecular WeightIonicIonicAnalyte PolarityIonSprayAPCIGC/MS4医学参考A现代有机和生物质谱进展现代有机和生物质谱进展 n在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分
3、子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达15002000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。n随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。5医学参考An目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。
4、前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。 6医学参考A质谱原理简介： n质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条
5、状图就是我们常见的质谱图。 7医学参考A8医学参考A常见术语:n质荷比质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.n峰峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.n离子丰度离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度.n基峰基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.n总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子多电荷离子；同位素离子9医学参考A总离子流图总离子流图:n在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图.10医学参考A
6、质量色谱图n指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图.n利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。11医学参考A 1.02.03.04.00102030405060708090100 1.02.03.04.05.06.00102030405060708090100质量色谱图质量色谱图总
7、离子流图总离子流图12医学参考A准分子离子准分子离子:n指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见的准分子离子峰是M+H+ 或M-H- .n在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子如M+1,M+23,M+39,M+18.称准分子离子,表示为:M+H+,M+Na+等13医学参考A碎片离子：n准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子.n碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。14医学参考AEphedrine, MW = 16515医学参考A多电荷离子： 指带有2个或更多电荷的离子,常
8、见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.采用电喷雾的离子化技术, 可产生带很多电荷 的离子,最后经计 算机自动换算成单 质/荷比离子。 16医学参考A同位素离子同位素离子n由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.n各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等1
9、7医学参考A如何看质谱图：n(1)确定分子离子确定分子离子,即确定分子量即确定分子量n氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在38和1013，2125之间均不可能，则说明是碎片或杂质。18医学参考A(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式n高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式n低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:19医学参考A(3)峰强度与结构的关系n丰度大反映离子结构稳定n在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这
10、同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。20医学参考An不同类型有机物有不同的裂解方式n相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异n需要经验记忆。21医学参考A质谱解析的一般步骤n(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好) n(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当n(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等.22医学参考An(3) 尽可能判断出分子离子。n(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31.意味着失
11、H，CH3，H2O，HF，OCH3.n (5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。23医学参考A有机质谱的特点n优点优点:n(1)定分子量准确，其它技术无法比。n(2)灵敏度高，常规10-710-8g,单离子检测可达10-12g。n(3)快速，几分甚至几秒。n(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难分离的混合物特别有效, 其它技术无法胜任。n(5)多功能，广泛适用于各类化合物。24医学参考A局限性局限性:n(1)异构体，立体化学方面区分能力差。n(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专人操作。n(3)
12、有离子源产生的记忆效应，污染等问题。n(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。25医学参考A质谱仪器： n质谱仪由以下几部分组成n n 数据及供电系统n n进样系统 离子源 质量分析器 检测接收器 n n 真空系统 26医学参考A真空系统 n质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。n由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。n只有在足够高的真空下，离子才能从离子
13、源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。27医学参考A进样系统n把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样等。28医学参考A离子源n使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离子进行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的有如下几种，其中EI，ESI最常用。29医学参考AnEI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离硬电离。 nCI(Chemical Ionization):化学电离核心是质子转移。 nFD(Field Desorption):场解吸目前基本被FAB取代。nFAB(Fast At
14、om Bombardment):快原子轰击或者铯离子 (LSIMS,液体二次离子质谱 ) 。n ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)n APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离同上，更适宜做弱极性小分子。nAPPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电离同上，更适宜做非极性分子。n MALDI(Matrix Assisted Laser Desorpt
15、ion):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子30医学参考An其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离统称大气压电离(API)31医学参考A实验室现有的离子源:nESI电喷雾电离源nAPCI大气压化学电离源32医学参考A33医学参考A电喷雾（电喷雾（ESIESI）的特点）的特点 n通常小分子得到M+H+ +,M+Na+ 或M-H-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。n电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳
16、定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。34医学参考A35医学参考A大气压化学电离（大气压化学电离（APCI）特点）特点 n大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。36医学参考A电喷雾与大气压化学电离的比较n电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成MH+或M-H-离子。n样品流速：APCI源可从0.2到2 mlmin；而电喷雾源
17、允许流量相对较小,一般为0.2-1 mlmin.n断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.n灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。n多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子37医学参考ANanoSpray 离子源n专门设计的 NanoSpray 离子源特别适合于做微量的生化样品，其流速范围可从 5nLmin到luLmin。一滴样品就可做数小时的分析。可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。灵敏度可高达fmole。并可直接与微孔HPLC联用。38医学参考A正负离子模式:n一般的商品仪
18、器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。n根据样品的性质选择，也可两种模式同时进行39医学参考A质量分析器质量分析器:n是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。40医学参考A质量分析器的分类：n双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).n四极质谱仪(Q).n飞行时间质谱仪(TOF).n离子阱质谱仪（TRAP）n付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS). n 四极+TOF（Q-TOF）n串列式多级质谱仪三重四极（QqQ） (MS/MS) TOF+TOF41医学参考A进行MS/MS的仪器
19、从原理上可分为两类n第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。即前面列出的串列式多级质谱仪。n第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有存储离子的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪。但不能进行母离子扫描或中性丢失。42医学参考A43医学参考A实验室现有的质量分析器类型：n串联四极质谱仪(MS/MS) ： 三重四极（QqQ）离子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q344医学参考AnQqQ仪器可以方便的改变离子的动能，因此扫描速度快，体积小，常作为台式进入常规实验室，缺点是质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定，只能
20、做到单位质量分辨。（通过高分辨能得到化合物的分子式）45医学参考An在液质联机中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式输送给分子离子，这个能量足以使得处在能量亚稳态分子中的某些化学键断裂并使一些特定的分子发生结构重排。46医学参考A碰撞诱导解离CID质谱：n选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(碰撞气体： N2、He、Ar、 Xe、CH4等) ，发生离子分子碰撞反应，从而产生子离子，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID (collision-induced dissociation)谱47医学参考A影响CID质谱的因素：n较大影响的因素有：所用碰
21、撞气体的种类，压力，离子的能量，仪器的配置以及离子电荷状态n由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品，任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱，尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的。因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用，只能进行人工解析或自己建库。48医学参考An大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子，其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生，所以在EI质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释。49医学参考A检测接收器：n接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板50医学参考A数据及供电系统n将接
22、收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。n从几伏低压到几千伏高压。51医学参考ALC-MS分析条件的选择和优化n1.接口的选择： ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质） APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。52医学参考A2.正、负离子模式的选择：选择的一般原则为：n正离子模式：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。n负离子模式：负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化
23、。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。53医学参考A3.流动相的选择n常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。nLCMS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5 mmol/l。n送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。54医学参考A4.流量和色谱柱的选择n不加热ESI
24、的最佳流速是150ulmin，应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm内径的微柱，TIS源最高允许lmlmin，建议使用200400ulminnAPCI的最佳流速lmlmin，常规的直径4.6mm柱最合适。n为了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。55医学参考A5.辅助气体流量和温度的选择n 雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。n操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而
25、言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20 左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。n选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。56医学参考A样品的预处理：n为什么要进行样品的预处理：n从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。n要求获得最佳的分析结果，从ESI电离的过程分析：ESI电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能。57医学参考A样
26、品的预处理常用方法样品的预处理常用方法na）超滤nb）溶剂萃取去盐nc）固相萃取nd）灌注（Perfusion）净化去盐ne）色谱分离n 反相色谱分离n 亲和技术分离nf）甲醇或乙腈沉淀蛋白ng）酸水解，酶解nh）衍生化58医学参考A化合物鉴别n全扫描方式（Q1扫描） 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子，从而可判断出化合物的分子量，用于鉴别是否有未知物，并确认一些判断不清的化合物，如合成化合物的质量及结构。 n子离子分析（ MS/MS ） 子离子，用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选择离子对作多种反应监测（MRM）。 子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内CID）可能十分相似，
27、所不同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过MS1，因此也已知所有碎片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由MS/MS产生的谱图的纯度。59医学参考A用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息n正离子方式常出现如下离子:n-Na 22 Da. higher than M+Hn-K 38 Da. higher than M+Hn-Li 6 Da. higher than M+Hn-NH4 17 Da. higher than M+Hn-ACN 40 Da. higher than M+Hn2M+H,2M+Na等n负离子方式常出现如下离子:n-TFA 1
28、14 Da. higher then M-H (113 and 227 background)n-Acetate 60 Da. higher then M-Hn-Formic 46 Da. higher then M-Hn-Cl 36 Da. higher than M-H 60医学参考A影响分子量测定的因素n1）pH的影响：正离子方式pH要低些，负离子方式pH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形。n2）气流和温度：当水含量高及流量大时要相应增加。n3）溶剂和缓冲液流量：流速适当高可以提高出峰的灵敏度。n4）溶剂和缓冲液的类型：通常正离子用甲醇好，负离子乙腈好些n5）选择合适的液相色谱
29、类型：正相、反相、选择合适的色谱柱n6）合适的电压：DP电压高时，样品在源内分解或碎裂；高DP电压时回使多电荷离子比例低，多聚体也减少n7）样品结构和性质n8）杂质的影响：溶剂的纯度、水的纯净程度等。当成分复杂，杂质太多时，竞争使被测物离子化不好，同时使LC分离不好n9）样品浓度不够，有时需要浓缩61医学参考A分子量测定中的误判n溶剂中的杂质n来自于塑料添加剂的峰n样品容器不干净，常见表面活性剂的峰n进样系统污染n样品在源内碎裂，形成碎片离子62医学参考ALC-MS中常见的本底离子中常见的本底离子nm/z 50-150, 溶剂离子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 nm/z 102, H+
30、乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549nm/z149, 管路中邻苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233nm/z 288, 2mm 离心管的产生的特征离子nm/z 279, 管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591nm/z 316, 2mm 离心管的产生的特征离子nm/z 384, 瓶的光稳定剂产生的离子nm/z391, 管路中邻苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843nm/z413, 邻苯二甲酸二辛酯+钠, C24H38O4Na+, 413.2668nm/z 538, 乙酸+氧 +铁（喷雾管）, Fe3O(O2CCH3)6
31、, 537.8793 63医学参考A分子量测定失败的原因na）流动相不合适nb）不挥发性盐的影响nc）成分复杂，杂质太多nd) 样品浓度不够ne）pH值不合适nf）样品在源内分解或碎裂64医学参考A目标化合物分析n（1）选择离子监测（SIM） SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。 若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子.65医学参考A目标化合物分析n（1）选择离子监测（SIM） SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般
32、用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。 若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子.66医学参考A（3）母离子扫描n母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。 67医学参考A(4)中性丢失扫描 中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断，例如有中性丢失18Da的意味着-H2O，28-CO，30-HCOH，32-CH3OH，44-CO2等等。68医学参考A各种扫描方式的原理解释：
33、nQ1 Full Scan (Start Stop)(Q1全扫描)nQ1 always used as single MS analyzernUsed primarily for ident. of precursor ion69医学参考ASIM - Selected Ion Monitoring(选择离子监测选择离子监测)nUsed to optimize analyzer for specific ionsnSIM used for quantitative analysesnQ1 SIM used to “optimize” precursor ionnMaximize signal i
34、n preparation for MS/MS70医学参考AProduct Ion Scan(子离子扫描子离子扫描)-After identification, the precursor ion is sent into the collision cell and fragmented by CID-Q1 is fixed, Q3 sweeps a given mass range-Used for structural elucidation-First step to developing quantitative methodm3+ scannedm1+ fixed71医学参考AEx
35、ample of Product Ion SpectrumEphedrine, MW = 16572医学参考APrecursor Ion Scan(母离子扫描母离子扫描)Q1 sweeps a given mass range, Q3 is fixedUsed to determine the “origin” of particular product ion(s) created in the collision cellFrequently used for drug metabolite identification (common product ion observed in th
36、e metabolites)m3+ fixedm1+ scanned73医学参考AExample of Precursor Ion Spectrum600900120015001800m/z, amu5 8 7 .57 4 5 .68 9 5 .68 0 2 .46 3 3 .4520.31105.01704.4600900120015001800m/z, amu3.0e66.0e69.0e61.2e7Intensity, cps6 0 8 .3520.3802.4600900120015001800m/z, amu3.0e46.0e49.0e4Intensity, cpsPrecursors
37、 of 86 (Ile/Leu)Q1 Scan745.674医学参考AFragmentationnWhen an Ion fragments the following formulas apply:nPositive moden (Parent)+ A+ + B NeutralnNegative moden (Parent)- A- + B Neutral75医学参考ANeutral Loss Scan(中性丢失扫描中性丢失扫描)Q1 & Q3 both scan a given mass range but with a constant difference between ranges
38、 scannedSpectrum indicates which ions lose a neutral species equal to Q1 - Q3 differenceComplement to Precursor Ion ScanNeutral “gain” indicates a multiply charged precursor ion was fragmentedmm1+ scannedm3+ scanned76医学参考AMultiple Reaction Monitoring (MRM)Precursor ion fixedProduct ion fixedFragment
39、ation(CAD)Many precursor to product ion pairs can be monitored (A-B, A-B, etc.)MRM is the best way to maximize signal intensity of product ionsMRM used primarily for quantitation77医学参考AWhy LC/MS/MS for Quantitation ?Retention Time Retention TimeIntensityIntensityPrecursor ion fixedProduct ion fixedF
40、ragmentation(CAD)Increased Sensitivity & Specificity78医学参考A仪器介绍:n4000QTRAPTM四极杆-四极杆-线性离子阱串联质谱仪是美国应用生物系统公司最新推出的、具有革新性设计的液相色谱-串联质谱仪。它把四极杆-线性离子阱质谱技术首次结合在一起，既保留了串联四极杆质谱仪的优点如母离子扫描（PS）、中性丢失扫描（NL）、MRM定量功能，又克服了传统3D离子阱质谱仪的缺点如低质量截止点（1/3效应）、“空间电荷效应”、碰撞效率低、定量性能差等。它是一台集优异定性功能与定量功能于一体的质谱仪，广泛应用于蛋白质（组）研究、药物开发、药物代谢、
41、有机化学、环境分析、毒物分析、食品检验、商品检测、卫生防疫、烟草品质改良等众多领域。 79医学参考Aq0Q1q2Q3线性离子阱：线性离子阱：超大的离子超大的离子容量：消除了传统离子阱容量：消除了传统离子阱的的“空间电荷效应空间电荷效应”80医学参考A低质量截止(1/3 效应)低碰撞效率（离子缺失）81医学参考An多电荷增强扫描功能多电荷增强扫描功能：有效消除单电荷离子的干扰，只检测多电荷离子，更适合检测微量的肽或蛋白质nMS3功能：功能：MS3功能和串联四极杆碰撞方式，只需进行最少的实验却提供最充分的结构信息n动态线性范围宽动态线性范围宽保留3Q质谱仪的优异MRM定量性能，能够检测复杂基质中的
42、微量杂质82医学参考AQTRAP实现MSn功能以利血平为例:第一步做母离子609的MS2谱，由于碰撞能量较高，既有一次碰撞碎片又有多次碰撞碎片，且无1/3质量CUT OFF现象，故从低质量端到高质量端产生碎片很多。每个碎片均可做MS/MS/MS，从中确证下一级的碎片归属，进而推断分子结构。例如M/Z236和M/Z195是由M/Z448产生， M/Z365和M/Z174是由M/Z397产生。M/Z365,M/Z236和M/Z195还可继续打碎。83医学参考ARESERPINE-MS/MS84医学参考ARESERPINE-MS/MS/MS（448）85医学参考ARESERPINE-MS/MS/MS
43、（397）86医学参考ARESERPINE-MS/MS/MS（365）87医学参考ARESERPINE-MS/MS/MS（195）88医学参考ALC-MS技术的应用n以大气压电离为接口的LC-MS技术已经在药物、化工、临床医学、分子生物学等许多领域中获得广泛的应用89医学参考A具体应用领域n医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析n生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖n环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析n临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸n食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物n法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测n兽医学：
44、兴奋剂、磺胺类药物、抗体n合成化学：有机金属化合物、有机合成物n有机化学：表面活性剂、染料90医学参考A药物代谢研究药物代谢研究 n药物代谢与药物动力学研究技术上的最新重大进展是LC-MS-MS的使用，电喷雾（ESI）和大气压化学电离（APCI）以及大气压光电离（APPI）是其主要的离子源，由于具有高灵敏度（ng/mlpg/ml），高选择性（检测特定的碎片离子）、高效率（每天可检测几百个生物样品和对药物结构的广泛适用性，对液态样品和混合样品的分离能力高，可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构，LC-ESI-MS-MS已广泛地应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应产物的鉴定、复杂
45、生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等，已在世界上大型制药企业中取代HPLC而占据了主导地位，其测试的样品量占总量的70%以上。91医学参考A天然产物天然药物的研究天然产物天然药物的研究n目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中提取一种有效成分(单体化合物)或提取物开发成新药。另一途径则是中药复方制剂的开发研究。 n采用现代多种仪器联用新技术，特别是高效液相色谱/质谱/质谱联用(HPLC-MS/MS)，可对其十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱分离鉴定。再从指纹图谱中选择四、五种指标成分(有效成分或特征成分)进行定量，可以确定出简化的指纹图谱和指标成分，又是最合理的中药复方质量控制
46、的方法，是研究中药复杂体系，尤其是复方的有力工具。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。 92医学参考A临床诊断和疾病生物标志物的分析临床诊断和疾病生物标志物的分析 n 欧美等目前已广泛采用HPLC/MS/MS法用于临床诊断以及疾病生物标志物的研究、检测，具有专一性好、灵敏度高、成本低、分析快速，经济效益可观等特点。目前可进行新生儿遗传疾病筛选（PKU、MCAD等四十种左右）、新生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年痴呆症的早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红蛋白变异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏病、癌症疾病筛查如
47、乳腺癌等等（Biomarker法、通过鉴定DNA损伤程度测定）、药物剂量监测、药物相互作用监测、地区性突发性中毒病人的毒物检测等。 93医学参考A残留、法医学和环境样品测定残留、法医学和环境样品测定n专家指出，中国入世后，食品工业最大的问题就是安全壁垒，这将给中国的进出口和国内企业带来极大的威胁。美国食品与药品管理局 (FDA)、欧盟、日本、韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。这就要求中国加强农、畜、水产品中的农药、兽药等残留的控制和检测。n同样随着人类对生存环境的倍加关注，要求对环境中各种污染物、有害或有毒物以及法庭科学中毒物、滥用药物等进
48、行更加严格的监控。而配以ESI、APCI和APPI离子化技术的LC/MS/MS以分析速度快、灵敏度高、特异性好等特点广泛应用与残留和毒物分析。目前已成功地进行数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素如氯霉素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化合物的检测。94医学参考A下面讲解应用示例下面讲解应用示例95医学参考A高效液相色谱高效液相色谱电喷雾串联质谱电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸法测定清开灵复方中胆酸 n采用HPLC/MS/MS技术，从清开灵注射液中，通过分子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。 n直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（ES
49、I）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰M-H-，再用二级质谱（MS/MS）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。 96医学参考A通过对样品进行分子离子峰的扫描发现M-H-的峰中有一个很强的407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为408）。如图所示：通过对照样品(右)和标准品（左）的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。 97医学参考A98医学参考A99医学参考A100医学参考A101医学参考A102医学参考A103医学参考A104医学参考A105医
50、学参考A106医学参考A107医学参考A如何用API LC-MS/MS检测硝基呋喃类代谢物108医学参考An第一步：第一步：配制衍生化后的硝基呋喃代谢物标准溶液，乙腈/水体系，浓度10PPMn确认仪器已经校准，气体、电压工作正常。n测试条件：n离子化方式: ESI+n进样5ul/min， Q1 SCAN 观察M/Z 335，236，249，209及同位素内标峰，通过调节DP，使这几个峰最强。n注意：注意：1如买来的是已经衍生化的标准品，则可四种混配。n 2如是用户由硝基呋喃代谢物衍生化的，最好四种分别配制，要求Q1 SCAN能明显观察到上述 离子。下图是一个用户的混标，只看到335和209。1
51、09医学参考A110医学参考An第二步：第二步：以第一步测得值为母离子，做PRODUCT ION SCAN（MS2），调节CE等参数，使母，子离子都具有一定强度，平滑后得到MS2谱，从各母离子中各选择2个最高的子离子，分别为呋喃它酮AMOZ： M/Z 291，262；呋喃唑酮AOZ： M/Z 134，104；呋喃妥因AHD： M/Z 134，104或178；呋喃西林SEM： M/Z 192，166，准确到0.1。注意注意：母离子要采用Q1SCAN测得值，子离子采用PRODUCT ION SCAN测得值。典型MS2谱图如下111医学参考AAMOZ112医学参考AAMOZ-D5113医学参考AAO
52、Z114医学参考AAHD115医学参考AAHD内标（选252/134 ）116医学参考ASEM内标（选212/195）117医学参考An第三步：第三步：以第二步选定的离子对，例如335.1/262.2 等，做MRM SCAN 。n第四步：第四步：通过软件操作优化各种参数，如温度、气流等。n第五步：第五步：接好色谱柱，编辑LC梯度洗脱，进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，否则调节流动相，优化色谱条件。n第六步：第六步：用空白提取液配制同样浓度标样，按上一步方法进样，观察色谱峰形及保留时间是否合适，峰高有无变化，有无离子抑制现象，否则调节流动相，优化色谱条件。n第七步：第七步：用空白提取液配制一
53、系列不同浓度硝基呋喃代谢物标样，按上一步方法进样，例如，分别稀释为浓度0.25ug/kg, 0.5ug/kg, 1.0ug/kg, 2.0ug/kg, 4.0ug/kg, 8.0ug/kg, 等等。118医学参考An第九步：第九步：按上述方法采集数据，做标准曲线,并进行硝基呋喃代谢物样品的测定。如果4种同位素内标齐全，则定量时一一对应计算，如只有AOZ-D4和AMOZ-D5，则1种内标可对应2种硝基呋喃代谢物。119医学参考ASEM结果1120医学参考ASEM线性121医学参考A知识回顾知识回顾Knowledge Knowledge ReviewReview谢谢 谢！谢！ 放映结束 感谢各位的批评指导！让我们共同进步123医学参考A
