《rna转录与转录后加工.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《rna转录与转录后加工.doc(34页珍藏版)》请在金锄头文库上搜索。
1、第7章 RNA转录与转录后加工1 本章主要内容1) 转录的基本概念2) 大肠杆菌RNA聚合酶及其转录3) 真核生物的RNA聚合酶及其转录4) RNA的转录后加工和反转录2 教学目的和要求通过本章学习,掌握转录的基本概念,原核转录的主要参与者(RNA聚合酶和启动子)以及原核转录的过程(起始、延伸和终止)。1) 掌握真核转录的三种主要RNA聚合酶、所转录的基因类型和参与转录过程各种因子等。2) 了解不同前体RNA的加工机制。3) 了解反转录的特点3 重点难点1) 转录2) 大肠杆菌RNA聚合酶、原核转录的过程3) 真核生物的RNA聚合酶、真核转录过程、转录因子4) RNA的转录后加工、反转录4 教
2、学方法与手段讲授与交流互动相结合,采用多媒体教学。5 授课内容1) RNA转录概述2) 细菌基因的转录3) 真核生物的转录4) RNA的转录后加工5) RNA的反转录第一节 RNA转录概述 一、 信使的发现 1955年Brachet用洋葱根尖和变形虫进行实验: 若加入RNA酶,则蛋白质合成就停止; 若再加入来自酵母的RNA,又可合成蛋白质。 这表明什么? 同年Goldstein和Plaut用同位素标记变形虫RNA前体 发现标记的RNA在核内。 标记追踪实验:经过一段时间又发现被标记的RNA在细胞质中, 这表明什么? 1956年E. Volkin和 L.Astrachan: 用同位素脉冲一追踪标
3、记 表明T2噬菌体新合成的RNA的碱基比和自身的DNA碱基比相似,而和细菌的碱基比不同。T2感染细菌时注入的是DNA,而在细胞里合成的是RNA。 这表明什么? 最令人信服的证据是Hall.B.D和Spiegeman,S的DNA-RNA的杂交实验: 将T2噬菌体感染E.coli后产生的RNA分离出来,分别与T2和E.coli的DNA进行分子杂交。 结果这种RNA只能和T2的DNA形“杂种”链,而不能和E.coli的DNA进行杂交。Jacob和Monod预言:(1)这种“ 信使”应是一个多核苷酸;(2)其分子平均不小于5105bp,足以携带一个基因的遗传信息;(3)它们至少是暂时连在核糖体上;(4
4、)其碱基组成反映了DNA的序列;(5)它们能高速更新。 Jacob和Monod将它定名为: 信使RNA (Messenger RNA) 或mRNA。二、 几个基本概念 转录(transcription):是指以DNA为模板,在依赖于DNA的RNA聚和酶催化下,以4种rNTP(ATP、CTP、GTP和UTP)为原料,合成RNA的过程。 在有些病毒中,RNA也可以指导合成RNA。 转录是基因表达的第一步,也是最关键的一步。三、 RNA合成的基本特点 1960年Weiss,S,B等发现RNA聚合酶(RNA Pol)。其特点是:(1)以核糖核苷三磷酸(rNTR)为底物;(2)以DNA为模板;(3)按5
5、-3方向合成;(4)无需引物的存在能单独起始链的合成;(5)第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在;(6)在体内DNA双链中仅一条链作为模板;(7)RNA的序列和模板是互补的。确定有义链 1963 J.Marmur和Doty Spiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料,SP8 DNA 双链有“ 轻”、“ 重”差异明显。 现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链(antisen strand), 非模板链称为有义链(sense strand)或编码链。 在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。 怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5- 3方向进行的? E.co
6、li在 0C时需13秒钟才能加上一个核苷酸,但在37C每秒就可加上40个核苷酸; 利用这个差别以14C来标记U, 在0C培养E.coli,。 提取这种正在伸长的mRNA分子,发现 14C标记首先出现在伸长的3端,因此可以证明合成是延着5-3方向进行的。四、 RNA合成和DNA复制的区别(1) 转录时只有一条DNA链为模板,而复制时两条链都可作为模板;(2) DNA-RNA杂合双链不稳定,RNA合成后释放,而DNA复制叉形成后一直打开,新链和母成子链;(3) RNA合成不需引物,而DNA复制需引物;(4) 转录的底物是rNTP,复制的底物是dNTP;(5) 聚合酶系不同。第二节 细菌基因的转录
7、一、 细菌的RNA聚合酶1. 全酶 (Holo Enzyme)和核心酶(Core Enzyme) (1) 全酶(Holo Enzyme) 用于转录的 依靠空间结构与DNA模板结合 (与核心酶结合后引起的构象变化) 专一性地与DNA序列(启动子)结合 结合常数:1014mol 半衰期:数小时 (107mol 1秒以下) 转录效率低,速度缓慢( 的结合 )(2)核心酶(Core Enzyme) 作用于转录的延伸过程(终止) 依靠静电引力与DNA模板结合(蛋白质中碱性基团与DNA的磷酸根之 间) 非专一性的结合(与DNA的序列无关) 结合常数:1011mol 半衰期:60秒E.Coli RNApol
8、 的亚基组成core enzyme (3)全酶的组装过程 此外,新发现的一种亚基的功能尚不清楚。2. 各亚基的特点和功能(1) 因子 因子可重复使用 修饰RNApol构型 使Holo Enzyme 识别启动子的Sextama Box(35区), 并通过与模板链结合E.coli中不同的s因子可识别不同的启动子(2)因子 核心酶的组建因子 促使RNApol 与DNA模板链结合 前端因子使模板DNA双链解链为单链 尾端因子使解链的单链DNA重新聚合为双链(3)因子 完成NMP之间的磷酸酯键的连接; Editing 功能 (排斥与模板链不互补的碱基); 与Rho ()因子竞争RNA 3end; 构成H
9、oloenzyme 后,因子含有两个位点; I site (initiation site . Rifs): 该位点专一性地结合; ATP或者GTP (需要高浓度的ATP或GTP); E site(elongation site RifR): 对NTP非专一性地结合(催化作用和Editing功能).(4) 因子参与RNA非模板链(sense strand)的结合 (充当SSB) 有义DNA链结合位点( 亚基提供) DNA/RNA杂交链结合位点(亚基提供) 双链DNA解链位点(前端 亚基提供) 单链DNA重旋位点(后端亚基提供) 因子作用位点 原核生物RNApol (Core) 的结构与功能RN
10、A pol 执行多种功能(1) 识别DNA双链上的启动子;(2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链;(3) 通过阅读启动子序列,RNA pol确定它自己的转录方向和模板链;(4)最后当它达到终止子时,通过识别停止转录。二、 原核生物转录的起始延伸1启动子(promoter)的结构和功能 启动子(promoter):是指DNA分子上被RNA聚合酶识别并结合形成起始转录复合物的区域 ,它还包括一些调节蛋白因子的结合位点。 启动子由两个部分组成l 上游部分 CAP-cAMP结合位点: (基因表达调控的正控制位点) CAP(catabolite gene Activator Protein)降解物基因
11、活化蛋白,环腺苷酸(cAMP)的受体蛋白l 下游部分 RNApol的进入(结合)位点 35 10 包括识别位点和结合位点(R B位点)2 RNA聚合酶的进入位点(1)Sextama 框(Sextama Box) -35序列,RNA聚合酶的松弛(初始)结合位点 RNA聚合酶依靠其亚基识别该位点, 为转录选择模板识别位点(R位点) 大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度(RNApol 的因子)(2) Pribonow 框(Pribonow Box) -10序列是由Pribnow和Schaller(1975)发现,故也称为Pribnow框
12、盒(Pribnow box)。 -10序列,RNA聚合酶的牢固结合位点 结合位点(B位点) 一致序列:T80A95T45A60A50T9(TATPUAT),因此又称TATA Box 位置范围 4 到13(3)转录起始位点(I) 1位点 RNA聚合酶的转录起始位点 转录开始时模板上的第一个碱基在原核中常为A或G 而且位置固定典型启动子的结构3起始过程(1) 全酶与模板DNA接触,生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动;(2) 起始识别:全酶与35序列结合,产生封闭的酶-启动子二元复合物(closed binary complex);(3) 全酶紧密地结合在-10序列处,模板DNA局部变性,形成
13、开放的启动子二元复合体;(4) 酶移动到I,第一个rNTP转录开始,因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体(ternary complex)。图起始过程图RNA核心酶和全酶在DNA上的分布: 和1/3的RNA pol结合成全酶,或在非特异位点的松散复合体中,或在启动子中的二元复合体中; 其中半数的核心酶从事转录; 余下的核心酶大量存在于闭合松散复合 体中; 估计数量很少的全酶是游离的。4RNA链延伸三 原核生物转录的终止1 终止子的种类(1) 不依赖 因子的终止子(内在终止子) : 体外实验中,只有核心酶和终止子就足以 使转录终止(2) 依赖因子的终止子:蛋白质辅助因子 因子存在时,核心
14、酶终止转录 两者有共同的结构特征(序列差异)不依赖 因子的终止子(强终止子) 结构特征: 一是形成一个发夹结构 茎. 720 bp的IR序列形成(富含G/C) 环.中间不重复序列形成 发夹结构的突变可阻止转录的终止 二是6 8 个连续的U串(发夹结构末端)、依赖 因子的终止子a 结构 IR序列中的 GC 对含量较少 发夹结构末端没有固定特征b 靠与的共同作用而实现终止2 原核生物转录的终止(1)不依赖因子的终止子终止转录新生RNA链发夹结构形成 造成高度延宕(典型的有60秒左右)RNApol暂停为终止提供了机会 ,6 8个连续的U串可能为RNApol与模板的解离提供了信号 RNADNA之间的 rUdA 结合力较弱 于是:RNA