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1、分子生物学实验ExperimentsofmolecularbiologyStillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望分子生物学实验室要求分子生物学实验室要求1.1.穿实验服进入实验室；2.2.保持实验室安静；3.3.保持实验室清洁干净和实验台面整洁；4.4.实验前要预习实验教材；5.5.不准穿拖鞋进入实验室；6.6.不准在实验室吃东西、喝水；7.7.要求刷卡进入实验室；实验一核酸的提取（质粒DNA的提取和纯化）【目的要求】【目的要求】1学习载体的基本结构2了解碱裂解法质粒提取过程
2、中各步骤的设计思想；3掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和各项基本技术；【实验原理】【实验原理】l l碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNADNA和线性染和线性染色体色体DNADNA在拓扑学上的差异来分离质粒在拓扑学上的差异来分离质粒DNADNA。在。在pHpH值介值介于于12.0-12.512.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的这个狭窄的范围内，线性的DNADNA双螺旋结构双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNADNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密的氢键会被断裂，
3、但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入地结合在一起。当加入pH4.8pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复乙酸钾高盐缓冲液恢复pHpH至至中性时，共价闭合环状的质粒中性时，共价闭合环状的质粒DNADNA的两条互补链仍保持在的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNADNA的两条的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNADNA与不稳定的与不稳定的大分子大分子RNARNA，蛋白质，蛋白质-
4、SDS-SDS复合物等一起沉淀下来而被除复合物等一起沉淀下来而被除去。去。 【实验材料和用品】【实验材料和用品】恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、Enpendorf管、含pET-29a质粒及含目的基因质粒的大肠杆菌、碱裂解溶液，酚、氯仿、乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶 【实验步骤】【实验步骤】【实验步骤】【实验步骤】1.Picksinglecolonyandinoculate5mlof1.Picksinglecolonyandinoculate5mlofLBbrothLBbrothcontainingcontaining200g/lAmpicillinor1mg/5mlwithalo
5、osenedcapanda200g/lAmpicillinor1mg/5mlwithaloosenedcapandapieceoftapetoholditinplace.Shakeat250RPM37pieceoftapetoholditinplace.Shakeat250RPM37o oCCovernight.overnight.2.Centrifuge1.5mLcellsin1.5mLEppendorftubeattopspeed2.Centrifuge1.5mLcellsin1.5mLEppendorftubeattopspeedfor1minute.Discardsupernatant
6、.for1minute.Discardsupernatant.3.Resuspendcellpelletin100ulof3.Resuspendcellpelletin100ulofGTEbufferGTEbuffer(50mM(50mMGlucose,25mMTris-Cl,10mMEDTA,pH8).VortexgentlyGlucose,25mMTris-Cl,10mMEDTA,pH8).Vortexgentlyifnecessary.ifnecessary.4.Add100ulof4.Add100ulofNaOHandSDSlysissolutionNaOHandSDSlysissol
7、ution(0.2MNaOH,(0.2MNaOH,1%SDS)respectively.Inverttube6-8times.1%SDS)respectively.Inverttube6-8times.5.IMMEDIATELYadd150ulof5.IMMEDIATELYadd150ulof5Mpotassiumacetatesolution5Mpotassiumacetatesolution(pH4.8)(pH4.8).ThissolutionneutralizesNaOHinthepreviouslysis.ThissolutionneutralizesNaOHintheprevious
8、lysisstepwhileprecipitatingthegenomicDNAandSDSinanstepwhileprecipitatingthegenomicDNAandSDSinaninsolublewhiteprecipitate.Spinattopspeed1min.insolublewhiteprecipitate.Spinattopspeed1min.6.Transfersupernatanttonewtube,beingcarefulnottopickup6.Transfersupernatanttonewtube,beingcarefulnottopickupanywhit
9、eflakes.Precipitatethenucleicacidswith0.5mLofanywhiteflakes.Precipitatethenucleicacidswith0.5mLofisopropanolonicefor10minutesandcentrifugeattopspeedisopropanolonicefor10minutesandcentrifugeattopspeedfor1minute.for1minute.7.Aspirateoffalltheisopropanolsupernatant.Dissolvethepellet7.Aspirateoffallthei
10、sopropanolsupernatant.Dissolvethepelletin0.4mlofin0.4mlofTEbufferTEbuffer(10mMTris-Cl,1mMEDTA,pH7.5).(10mMTris-Cl,1mMEDTA,pH7.5).Add10ulofRNAseAsolution(20mg/mlstockstoredat-20Add10ulofRNAseAsolution(20mg/mlstockstoredat-20C),vortexandincubateat37Cfor20to30minutestoC),vortexandincubateat37Cfor20to30
11、minutestodigestremainingRNA.digestremainingRNA.8.ExtractproteinsfromtheplasmidDNAusing8.ExtractproteinsfromtheplasmidDNAusingphenol/chloroform/isoamylalcohol(PCIA)byaddingaboutphenol/chloroform/isoamylalcohol(PCIA)byaddingabout0.4ml.Vortexvigorouslyfor30seconds.Centrifugeatfull0.4ml.Vortexvigorously
12、for30seconds.Centrifugeatfullspeedfor5minutesatroomtemperature.NoteorganicPCIAspeedfor5minutesatroomtemperature.NoteorganicPCIAlayerwillbeatthebottomofthetube.layerwillbeatthebottomofthetube.9.RemoveupperaqueouslayercontainingtheplasmidDNA9.RemoveupperaqueouslayercontainingtheplasmidDNAcarefullyavoi
13、dingthewhiteprecipitatedproteinlayerabovecarefullyavoidingthewhiteprecipitatedproteinlayerabovethePCIAlayer,transferringtoaclean1.5mleppendorftube.thePCIAlayer,transferringtoaclean1.5mleppendorftube.10.Repeat9stepagain.10.Repeat9stepagain.11.Add1mlofabsoluteethanoltoprecipitatetheplasmidDNA11.Add1ml
14、ofabsoluteethanoltoprecipitatetheplasmidDNAand50mlof3MSodiunacetatesolutiononicefor10and50mlof3MSodiunacetatesolutiononicefor10minutes.Centrifugeatfullspeedfor5minutesatroomminutes.Centrifugeatfullspeedfor5minutesatroomtemperature.temperature.12.DiscardethanolsolutionandresuspendDNApelletin50ulof12.
15、DiscardethanolsolutionandresuspendDNApelletin50ulofTEbuffer.TEbuffer.13.Dissolve5uLin995ulofwater,andspec(blank13.Dissolve5uLin995ulofwater,andspec(blankspectrophotometertowater).Theabsorbanceat260nmspectrophotometertowater).Theabsorbanceat260nmmultipliedbytenistheconcentrationoftheDNAinunitsofmulti
16、pliedbytenistheconcentrationoftheDNAinunitsofmg/mlfora1cmpathlengthcuvette(i.e.50mg/ml/ODmg/mlfora1cmpathlengthcuvette(i.e.50mg/ml/OD260nm).260nm).14.Storeitat-20C.14.Storeitat-20C.核酸的分离与纯化 不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非酸的分离与提取是生化与分子生
17、物学研究中非常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。系到实验的成败。 核酸的种类：核酸的种类：真核生物的染色体真核生物的染色体DNADNA为双链线性分子；真核细胞为双链线性分子；真核细胞器器DNADNA为双链环状分子；为双链环状分子；原核生物的基因组原核生物的基因组DNADNA、质粒、质粒DNADNA为双链环状分子；为双链环状分子；RNARNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不同类型的同类型的RNARNA分子可具有不同的结构特点，如真核分子可具有不同的结构特点，如真核mRNAmRNA分子多数在
18、分子多数在3 3端带有端带有ploy(A)ploy(A)结构结构;tRNA ;tRNA 的三的三叶草结构。叶草结构。病毒的病毒的DNADNA、RNARNA，其存在形式多种多样，有双链环，其存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状等。状、单链环状、双链线状和单链线状等。一、核酸分离提取的原则 1.1.分离纯化核酸总的原则分离纯化核酸总的原则 2.2.应保证核酸一级结构的完整性；应保证核酸一级结构的完整性；3.3.排除其它分子的污染，保证较高纯度。排除其它分子的污染，保证较高纯度。3.为为了了保保征征分分离离核核酸酸的的完完整整性性和和纯纯度度，在在实实验验过程中，应注意以下事宜
19、：过程中，应注意以下事宜：尽尽量量简简化化操操作作步步骤骤，缩缩短短提提取取过过程程，以以减减少少各种有害因素对核酸的破坏；各种有害因素对核酸的破坏；减减少少化化学学因因素素对对核核酸酸的的降降解解，为为避避免免过过酸酸、过过碱碱对对核核酸酸链链中中磷磷酸酸二二酯酯键键的的破破坏坏，操操作作多多在在pH4-10pH4-10条件下进行；条件下进行；减减少少物物理理因因素素对对核核酸酸的的破破坏坏，物物理理破破坏坏因因素素主要是机械剪切力，其次是高温。主要是机械剪切力，其次是高温。 防防止止核核酸酸的的生生物物降降解解，细细胞胞内内或或外外界界的的各各种种核核酸酸酶酶（ DNADNA酶酶、 RNA
20、RNA酶酶）酶酶解解核核酸酸链链中中的的磷磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。 其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活性。 而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。 l l提取高质量基因组DNA的主要用途： PCR扩增的模板 用于构建基因组文库 用于Southern blot 杂交分析二、真核细胞染色体二、真核细胞染色体DNADNA的制备的制备 真核细胞染色体真核细胞染色体DNAD
21、NA的制备过程的制备过程 1. 1. 真核细胞的破碎真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可导致DNA链的断裂。 （2）为了获得大分子量的DNA，一般采用蛋白酶K和去污剂温和处理法。 2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构建基因组文库。 根据不同的实验要求，可选择不同的实验方法制备真核细胞染色体DNA。 3.DNA沉淀：一般采用2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（0.6）4.DNA溶解：
22、一般采用TE三、RNA的分离与纯化 -真核细胞RNA的制备 从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多分子生物学实验至关重要。如Northern blot及cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上决定于RNA的质量。 RNA主要由以下几类分子组成：rRNA(占RNA总量的8085)、tRNA和核内小分子RNA(占10-15)、mRNA(占15)。 rRNA在总RNA分子中含量最丰富，由28S、18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大，分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子交换层析进行分离。 mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量
23、少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白及有些组蛋白mRNA以外)，均在3端存在20-250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分离mRNA。 mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白质，而mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。 鉴定所提取总RNA分子的质量，可以通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得28S、18S条带来判断。Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma reesei inducedbydifferentinducers图1.木霉总RNA的分离1.微晶纤维素2.天然稻草粉RNA RNA 分离的
24、关键因素是尽量减少分离的关键因素是尽量减少RNARNA酶的污染！酶的污染！如何创造一个无RNase的环境 ？极力避免外源RNase的污染：主要来源于操作者的手、实验的器皿和试剂尽力抑制内源性RNase的活力：主要来源于样品中的组织细胞。(1)操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留下RNase，说话带出的唾液也富含RNase。故整个操作过程中，应戴口罩和手套。(2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物，也是污染外源RNase的一条途径，所以操作过程应在比较洁净的环境中进行。怎样去除外源性RNase的污染？(3)玻璃器经过常规洗净后，应用0.1焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，
25、DEPC)浸泡处理(37，2小时)，再用双蒸灭菌水漂洗几次。高压消毒去除DEPC，然后200烘烤4小时以上或180烘烤过夜。(4)塑料器材最好使用灭菌的一次性塑料用品，Eppendorf管、微量加样吸头最好是新的，使用前进行高压蒸汽消毒。 (5)所有溶液应加DEPC至0.1，室温处理过夜，或室温下磁力搅拌20分钟，然后高压蒸汽灭菌处理（或加热至701小时或60过夜，以去除所有残留的DEPC）。(6)所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干烤处理的称量勺。所有操作均应在冰浴中进行，低温条件可减低RNA酶的活性。 要尽可能早地去除细胞内蛋白，加入RNase抑制剂，力争在提取的起始阶段对RNase活力
26、进行有效地抑制。 如何抑制内源性RNase的活性？RNase抑制物：（1）低特异性RNase抑制物： 不同类型的低特异性RNase抑制物均可不同程度地抑制Raise的活性，其中包括DEPC 皂土(bentonite):Al2O34SiO2H2O复合硅酸盐(Macaloid) 肝素氧钒基核苷复合物多胺（2）去除蛋白质的物质：蛋白质变性剂：酚、氯仿；尿素蛋白酶K去污剂：SDS、十二烷酰肌氨酸钠(sarkosyl)、脱氧胆酸钠(DOC)是阴离子去污剂解偶剂(胍类)：盐酸胍、异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，所以又称解偶剂。
27、（3）RNase的特异抑制剂 RNase阻抑蛋白(RNasin)： 这是一类从大鼠肝或人胎盘中提取出来的酸性糖蛋白质。RNasin能与RNase非共价结合从而抑制它们的活力，RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂。抑制效果较好，被广泛用于体外翻译体系、mRNA反转录合成cDNA及体外转录实验。 l lYouwillneed:Youwillneed:l lGuanidineisothiocyanate(Sigma)Guanidineisothiocyanate(Sigma)1Msodiumcitrate,pH7(DEPC-treated,autoclaved)1Msodiumcitrate,
28、pH7(DEPC-treated,autoclaved)Sarcosyl(Na-laurylsarcosine,Sigma)Sarcosyl(Na-laurylsarcosine,Sigma)b-mercaptoethanol(Sigma)b-mercaptoethanol(Sigma)2Msodiumacetate,pH4(DEPC-treated,autoclaved)2Msodiumacetate,pH4(DEPC-treated,autoclaved)3Msodiumacetate,100mMmagnesiumacetate,pH5.23Msodiumacetate,100mMmagn
29、esiumacetate,pH5.2AbsoluteethanolAbsoluteethanolPropan-2-ol(isopropanol)Propan-2-ol(isopropanol)70%ethanol(madewithDEPC-treated,autoclavedwater)70%ethanol(madewithDEPC-treated,autoclavedwater)0.5%SDS(madewithsterile,DEPC-treatedwater)0.5%SDS(madewithsterile,DEPC-treatedwater)SolutionD-4Mguanidineiso
30、thiocyanate,25mMsodiumSolutionD-4Mguanidineisothiocyanate,25mMsodiumcitrate,pH7,0.5%sarcosyl,100mMb-mercaptoethanol.citrate,pH7,0.5%sarcosyl,100mMb-mercaptoethanol.l lSolutionDcanbemadeandstoredat4Cwithoutb-SolutionDcanbemadeandstoredat4Cwithoutb-mercaptoethanolforseveralmonths.b-mercaptoethanolshou
31、ldmercaptoethanolforseveralmonths.b-mercaptoethanolshouldbeaddedto100mMimmediatelypriortouse.b-beaddedto100mMimmediatelypriortouse.b-mercaptoethanolisusedtopreventthereformationoftheintra-mercaptoethanolisusedtopreventthereformationoftheintra-moleculardisulphidebridges,oneofthereasonsforthemolecular
32、disulphidebridges,oneofthereasonsfortheextremestabilityofribonucleases.extremestabilityofribonucleases.l l1)Tissueishomogenizedasrapidlyaspossible,at4C,insolutionD1)Tissueishomogenizedasrapidlyaspossible,at4C,insolutionD(500ulper50mgtissue)withaneppendorfpestlehomogenizeruntila(500ulper50mgtissue)wi
33、thaneppendorfpestlehomogenizeruntilasmooth,lysed,homogenoussuspensionisobtained.smooth,lysed,homogenoussuspensionisobtained.l l2)Add50ul2Msodiumacetate,pH4.0andmixvigorously.2)Add50ul2Msodiumacetate,pH4.0andmixvigorously.l l3)Add500ulphenolandmixvigorously.3)Add500ulphenolandmixvigorously.l l4)Add10
34、0ulchloroform,mixvigorouslyandincubateonicefor154)Add100ulchloroform,mixvigorouslyandincubateonicefor15minutes.minutes.l l5)Centrifugemixtureat10,000gfor10minutesinamicrofugeat4C.5)Centrifugemixtureat10,000gfor10minutesinamicrofugeat4C.l l6)Removeupper,aqueousphasetoaclean,sterile,DEPC-treated6)Remo
35、veupper,aqueousphasetoaclean,sterile,DEPC-treatedeppendorftube.Aftercentrifugation,RNAispresentintheaqueouseppendorftube.Aftercentrifugation,RNAispresentintheaqueousphasewhile,duetoprotonationattheacidicpHused,genomicDNAisphasewhile,duetoprotonationattheacidicpHused,genomicDNAispartitionedintothephe
36、nolphase.partitionedintothephenolphase.l l7)Extracttheupperaqueouslayerwithanequalvolume7)Extracttheupperaqueouslayerwithanequalvolumephenol/chloroformandcentrifugeasbefore.Repeattheextractionsuntilphenol/chloroformandcentrifugeasbefore.Repeattheextractionsuntilnointerfacematerialisseen.nointerfacem
37、aterialisseen.l l8)Precipitatetheaqueousphasebytheadditionofanequalvolume8)Precipitatetheaqueousphasebytheadditionofanequalvolume(500ul)ofpropan-2-ol.Incubateat-20Cfor20minutes.(500ul)ofpropan-2-ol.Incubateat-20Cfor20minutes.l l9)PelletRNAbycentrifugationatmaximumspeedinamicrofugefor109)PelletRNAbyc
38、entrifugationatmaximumspeedinamicrofugefor10minutes.minutes.l l10)WashtheRNAoncein70%ethanolandvacuumdry.10)WashtheRNAoncein70%ethanolandvacuumdry.l l11)Re-dissolvein200ul0.5%SDSat65C.11)Re-dissolvein200ul0.5%SDSat65C.l l12)Extractwithanequalvolume(200ul)ofphenol/chloroformasabove.12)Extractwithaneq
39、ualvolume(200ul)ofphenol/chloroformasabove.Repeatuntilnointerfacematerialisvisible.Repeatuntilnointerfacematerialisvisible.l l13)PrecipitatepureRNAbytheadditionof20ul3Msodiumacetate,13)PrecipitatepureRNAbytheadditionof20ul3Msodiumacetate,100mMacetate,pH5.2and500ulabsoluteethanol.Incubateat-20C100mMa
40、cetate,pH5.2and500ulabsoluteethanol.Incubateat-20Cfor20minutes.for20minutes.l l14)PelletRNAbycentrifugationatmaximumspeedinamicrofugefor14)PelletRNAbycentrifugationatmaximumspeedinamicrofugefor10minutes.10minutes.l l15)WashtheRNAoncein70%ethanolandvacuumdry.15)WashtheRNAoncein70%ethanolandvacuumdry.
41、l l16)DissolveRNAinappropriatebufferi.e.DEPC-treated,sterileTE,pH16)DissolveRNAinappropriatebufferi.e.DEPC-treated,sterileTE,pH8or0.5%SDSifnoenzymicmanipulationoftheRNAisneeded.SDSis8or0.5%SDSifnoenzymicmanipulationoftheRNAisneeded.SDSisaninhibitorofribonucleases.aninhibitorofribonucleases.l lRNAqualitycanbeassessedbyelectrophoresisunderdenaturingRNAqualitycanbeassessedbyelectrophoresisunderdenaturingconditionsusingagarose/formaldehydegelsandtheMOPSbufferconditionsusingagarose/formaldehydegelsandtheMOPSbuffersystem.system.
