第三节大肠杆菌分子克隆载体 1精选ppt一、E.coli克隆载体的种类1.质粒载体复制起点来自一些天然质粒2.噬菌体载体，P1和M13、fd载体，复制起点来自噬菌体3.COS质粒载体质粒载体中插入cos片段，以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）有质粒和M13、fd的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制 2精选ppt二、质粒与质粒载体1.Ecoli的质粒种类1)colE1因子（大肠杆菌素因子）多数不能进行接合转移DNA，属高拷贝松弛型2)R因子（抗药性因子）可接合转移DNA，属低拷贝严紧型，质粒较大，操作不便3)F因子（性因子） 3精选ppt2.质粒的特点1)质粒DNA复制与染色体复制无关2)质粒DNA以超螺旋形式存在3)质粒DNA可以接合转移4)质粒的不相容性和不相容群5)质粒DNA的消除化学和物理法(吖啶染料，EtBr，高温等)6)质粒的整合F因子又可整合到E.coli染色体中3.质粒DNA的转移1）质粒DNA的转移过程 4精选ppt质粒的自主转移过程 5精选ppt质粒DNA的转移和复制 6精选ppt2）质粒转移的必备条件.转移起点(oriT),它是质粒DNA转移时的复制起点顺式作用（cis-action）ii.细胞附属物性纤毛，由蛋白质构成反式作用.转移过程所需的全部酶类反式作用3）质粒转移类型.自我转移（Self-transmissible）.辅助转移（Donation）可转移质粒仅具备oriT，若无辅助质粒，前者不会发生接合转移。
若辅助质粒可提供所有反式作用的蛋白质，前者便会发生接合转移重组转移（conduction）若质粒无oriT，该质粒只有整合到辅助质粒DNA中，重组质粒便可转移 因此，用于克隆外源DNA的分子克隆载体，只要具备oriT即可，另外两类功能基因可置于辅助质粒上，该质粒一般没有oriT，因而可以减少后者进入另一种细胞的频率 7精选ppt质粒自主转移质粒的辅助转移质粒的重组转移R-重组DNA分子 8精选ppt4.质粒DNA的复制和调节控制1)复制机制复制方向、终止和方式2)质粒拷贝数的控制抑制剂模型：高拷贝质粒需高浓度抑制剂，低拷贝质粒需低浓度抑制剂，同一不相容群质粒产生的抑制剂可交叉相互作用3)质粒的复制调控机制例子:ColE1质粒的复制及复制起点结构Borosetal.(1984)分离到一个pBR322突变体，其拷贝数可达1000/cell或65%总DNA，原因是在RNAI基因的3端附近发生一次GT颠换 9精选pptColE1质粒复制起点结构质粒DNA的复制过程 10精选ppt5.大肠杆菌质粒载体1)常用质粒载体的复制子质粒载体复制子来源拷贝数pBR322系列pMB115-20pUC系列pMB1500-700pACYC系列p15A10-12pSC101系列pSC10125colE1colE115-202)质粒载体常用的遗传标记基因AprCmrKanrNeorTcrHygrLacZLacZ3)多克隆位点区 大多数从pUC系列中的多克隆位点衍生出来的 11精选ppt6.实例pUC18和pUC19pUC系列质粒载体由Messingetal.构建，具有三个显著特点：1）分子量小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大2）易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ3）多克隆位点区.多克隆位点成对地存在于pUC18和pUC19中，位点排列顺序相同，但方向相反。
这种排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入.产生不同末端规律排列:两端限制酶位点产生5突起端（EcoRI和Hind），与之相邻的两个限制酶位点产生3突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四个限制酶位点产生5突起端或平端这种排列方式十分有利于插入DNA片段的单向缺失和缺失片段的回收 12精选pptpUC18和pUC19载体 13精选ppt如插入片段的5段定向缺失:XbaISphIExoS1T4DNAlingase;插入片段的3-端亦可采用类似的方法进行缺失（SmaISstIExoS1T4DNAlingase）不同载体中的多克隆位点区可以供不同目的片段的重组又例如:pBS+多克隆位点区的排列顺序是(见图)：假设有一EcoRIHindDNA片段，并要求在其3-末端或5-端接上另外的DNA片段（如终止子、启动子），显然，pUC系列载体的多克隆位点区是不太适宜，但选用pBS+中的多克隆位点区就能满足要求多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的绘制除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源基因（LacZ启动子） 14精选pptpBS载体的结构 15精选ppt三.噬菌体载体1.噬菌体载体1）的结构和特点i.一般结构：48,502bp，线状ds-DNA，两端具有12n.t5-突起（5-GGGCGGCGACCT-3）该末端称为cos位点，可被编码的末端酶所识别（该酶由末端的两个基因Nul和A编码蛋白gpNul和gpA组成）ii.基因结构46个基因，分为以下四类：)调控基因：C、N、CI、Cro、C决定进入溶源化还是裂解状态)DNA复制：O、P、Q)重组：int、xis、red和gam)噬菌体颗粒形成与细胞裂解：头(A-F)、尾(E-J)、S&R（细胞裂解）中部约1/3的DNA(b2)与存活无关。
16精选ppt大肠杆菌噬菌体的基因和表达调控 17精选ppt2)噬菌体基因的表达i.最早期转录：转录起始于CI基因两侧的PL和PR启动子，止于N和Cro末端的tL和tR1，有的右向转录物可継续通过O和P止于tR2ii.后早期转录：N蛋白可使宿主细胞转录终止因子失活，导致转录通过tR1、tR2和tL进入其余早期基因区域iii.后期转录：cro蛋白可与OL和OR结合，阻止RNA聚合酶与PL和PR结合，转录终止，此时已合成了足够多的控制蛋白Q，它对PR起激活作用，导致后期基因转录iv.DNA复制：因早期转录获DNA复制蛋白O和P，双向复制开始v.包装：Nul和A蛋白与DNA的cos位点的识别与切割，FI蛋白促进DNA进入头部蛋白，DNA充满后，gpw和gpF将头部封住，然后与尾部相连，形成噬菌体颗粒 18精选pptvi.裂解：基因R和S产物形成，细菌细胞裂解，噬菌体颗粒释放vii.溶源反应：C和C基因产物分别激活PE和PI的左向转录，致使CI和int基因表达，CI产物可阻止早期转录，导致后期基因表达受阻对于裂解反应和溶源反应的选择，取决于感染细胞中一系列宿主和噬菌体因子间错综复杂的精细平衡关系。
当DNA注入宿主细胞后，线状DNA首先环化为环状DNA，这种环化有以下几点好处：a.若为单向复制，不管从何处开始复制，全基因组均可全部复制b.噬菌体DNA插入宿主染色体DNA，只需一次位点特异性重组c.拓扑异构酶易于对其进行不足和过度加旋d.受损的基因组增大了存活的可能性，因为双向复制不会受阻于损伤的DNA链，而单向复制就不能通过 19精选ppt3)DNA的复制 20精选ppt4)DNA的包装过程 l头尾连接器由12分子gpB构成中空结构，groE1和groES负责装配 lpX由10个杂合的gpC和gpE构成，使连接器定位 lgpW和gpF结合在连接器上，防止DNA外泄，提供尾部粘着点末端酶由两基因产物组成（Nul和A），gpNul2-gpA1(20,444x2+72,280=113,168)该酶具有以下多种酶活性：1）特异DNA位点结合；2）特异位点切口形成；3）头前体结合；4）gpFI结合；5）cos位点变性；6）DNA转位；7）DNA序列扫描；8）ATP结合；9）ATP水解因此，头部蛋白gpE和gpD以及包装蛋白gpA是DNA形成噬菌体颗粒必不可少的组分，体外包装物的制备就是依据这一结论 21精选pptDNA的包装 22精选ppt5）DNA作载体的缺点和解决办法i.头部只能容纳自身DNA的78-105%，即39-52.5Kb，天然仅可插入3Kb外源DNA片段除去所有与裂解无关的基因和空白区，最大可插入22Kb。
ii.同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入体内突变和建立新的克隆位点重组的DNA分子难于直接导入宿主细胞利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNA6)载体的种类i.插入型即将外源DNA直接插入已构建载体中，如gt11，可以插入长达7Kb的DNA这类载体被限制酶切成左右臂取代型即利用一段外源DNA去取代载体中的一段DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因这类载体常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂有的取代型载体亦可用作插入型载体,如Charon4A 23精选ppt大肠杆菌载体Charon4ASpi重组子的筛选 24精选ppt7)载体的遗传标记基因和重组子筛选由于载体或重组DNA是通过感染途径进入宿主细胞的，因而形成的噬菌斑就是一个明显的标记用于重组子检测的遗传标记基因主要有lacZ基因不管是用插入或取代法，该标记基因均会失活利用spi-选择重组子：野生型不能在P2溶源化菌种中成活，称之为spi+(sensitivetoP2interference)，这与red和gam基因有关若用外源DNA将这些基因取代，形成的重组DNA分子可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑载体1059、L47.1均属此类，这种选择方式亦称之为显性选择。
25精选ppt2.P1噬菌体载体1)基本结构与特征i.基因组长88kb,在噬菌体颗粒中的DNA长100kb,呈线状,其中约有12%的多余DNA;ii.可以低拷贝质粒形式存在于细菌细胞中,又可以烈性噬菌体形式进行复制;iii.P1噬菌体包装原理:渐进满头机制（processiveheadfulmechanism）底物:滚环复制过程形成的头尾相连串状体 26精选ppt包装过程:始于一个长162bp的P1pac位点，识别和切割此位点的是P1编码的pacase，切出的pac一端进入预制头部，当其头部充满DNA后，DNA再次被切第二次切割是随机的，无特异性DNA序列第二轮包装则从非特异性切割出的末端开始因此，多次包装都是从一个pac位点开始的P1头部可容110Kbpac位点:一端含4个六聚体(5TGATCA/G3)，另一端则有三个，中间区域长90bp，pacase切点位于靠近90bp区的中心序列每个六聚体都有一个腺嘌呤甲基化位点(damGATC),pacase只作用甲基化的pac位点. 27精选ppt大肠杆菌P1噬菌体基因组和包装 28精选ppt2)P1载体-pAd10sacBi.优点i)可克隆较大插入片段,可插入95Kb外源DNA，二倍于cos质粒载体ii)较高的转化频率,12g载体+24g外源DNA105转化子iii)与YAC载体相比，它易于产生多拷贝的基因组片段;易于获得大量特定的克隆DNA;克隆过程更可靠;克隆片段易于进行次克隆ii.结构载体被二个loxP重组位点分隔为两区Ampr和Kanr区Ampr区：来自pBR322的ori,pac位点(反时针包装),来自腺病毒的11Kb填充片段(插入到Sca位点)Kanr区：Kanr(Tn903)和Tetr基因，P1质粒复制子和分离系统，P1裂解复制子，其活性受lac操纵基因启动子控制 29精选ppt大肠杆菌P1噬菌体载体pAd10sacB 30精选pptP1噬菌体载体构建基因组文库的示意图pAd10sacBScaI+BamHI长臂+短臂加入外源DNA片段重组DNA分子离体包装感染宿主细胞 31精选ppt SacB基因:编码一种将蔗糖转化为果聚糖的酶，当含该基因的细胞培养在2%以上蔗糖培养基中时,果聚糖积累在细胞周质空间内，导致大肠杆菌细胞死亡SacB基因被克隆到原Tetr基因的BamHI-SalI间,在其上游加上E.coli基因启动子,克隆位点BamHI位于这两个DNA片段间,外源DNA片段插入时可进行显性筛选重组子为了使sacB基因自发突变减小到最小限度,sacB基因上游还有一个P1C1阻遏物结合位点与其启动子重叠。
凡是表达P1C1基因的细胞，sacB基。