第四章 凝胶（排阻）层析中国医科大学实验技术中心孙晋民l1. 排阻层析(exclusion chromatography)，亦称分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gelfiltration)凡是利用生物大分子的相对分子质量(relativemolecular mass，Mr)差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析用于排阻层析的分离介质称为排阻层析介质在20世纪60年代初就开始使用凝胶介质分离生物大分子例如，用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持物分离血清中的蛋白质，凝胶在其中起分子筛作用后来人们将凝胶制成球形微珠，作为液相层析分离介质，用于分离生物大分子，并获得巨大成功现在使用的凝胶层析介质的用途远远超出了电泳分离介质的范畴，已成为分离纯化生物大分子最重要的分离介质之一，也是作为合成带有配基的层析介质应用最广泛的一种载体凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质 第一节第一节 概述概述l2.第二节 凝胶层析原理 一、基本原理 凝胶类层析介质是一种在球体内部具有大孔网状结构凝胶微粒，不同大小的网状孔径像筛子一样，可以把大小不同的生物大分子按一定的顺序进行分离，好像“目数”不同的普通筛子一样把大小不同颗粒分级筛分。
但是排阻层析与普通筛分的原理不同，排阻层析是按生物分子分子量的大小排序进行筛分的l3. 相对分子质量大的生物分子由于不能进入或不能完全进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对于小分子迁移的路径近，在柱内的停留时间短，保留值小，所以在层析过程中迁移率最快，走在小分子的前面，先从柱中流出；l4. 分子量小的分子由于能够进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状孔流过，相对于大分子迁移的路径长，在柱内的停留时间长，保留值大，所以在层析过程中迁移率最慢，走在大分子的后面，后从柱中流出l5. 样品中分子量大小不同的各种分子在流过凝胶内部网状孔时就受到凝胶介质排阻效应，也称为分子筛效应，将它们一个一个分离，从而达到分离的目的普通筛分是大颗粒不能通过筛子的筛孔而被截留在筛板的上面，小颗粒可以通过筛孔所以普通筛分与凝胶层析筛分的原理是不一样的排阻层析分离的基本原理如图所示l6.l7. 凝胶层析介质分离的分子主要分3部分第一部分是全排阻分子，也可称之为上限分子量，不能起筛分作用的大分子第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子第三部分是全渗透分子，称之为下限分子量，是不能起筛分作用的小分子。
l8. 从图可以看出，A-B之间为该凝胶的有效分离范围，可分离相对分子质量范围是1000100000，高于相对分子质量为100000的是全排阻分子，低于相对分子质量为1000的是全渗透分子 凝胶层析的分离范围示意图l9.二、参数的表示方法及其意义1.柱床体积 凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(total volume)表示，单位为ml2.外水体积 存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积，以Vo(outer volume)表示，单位为m1l10.3.内水体积 是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积以Vi(inner volume)表示，单位为m1 4.凝胶体积 是凝胶颗粒自身的体积，也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积,以Vg(gel volume)表示，单位为m1l11.l5.洗脱体积 自加样液时开始，到洗脱组分浓度最大时出现的峰(洗脱峰峰顶)为止，所收集的体积，以Ve(elution volume)表示，单位为m1l计算法：根据层析柱体积计算总体积可用下列公式表示l t=r2h 干凝胶用量（克） r2h 膨胀度（床体积克干胶）l12.三、参数之间的关系测量法1.床体积与Vo，Vi，Vg之间的关系式是： Vt=Vo+Vi+Vg (1-1)2.洗脱体积与Vo，Vi的关系式为： Ve=Vo+KdVi (1-2) 式中Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配系数，也可以视为相对分子质量不同的溶质在凝胶颗粒的内部和外部的分配系数。
它只与被分离物质相对分子质量的大小、凝胶颗粒空隙和网状孔径大小有关，与层析柱的长短和粗细无关Kd可以通过实验获得l13.3.Kd与体积之间的关系 可以将式(1-2)变换一下，即可得到Kd与体积之间的关系式：(1-3) Ve Vo Vi 式中 Ve-实验测得的实际洗脱体积 可用不被凝胶滞留的大的相对分子质量组分测得，通常用相对分子质量在2106的蓝色葡聚糖-2000测定，可以通过干胶的吸水量(每克干胶所吸附水的毫升数)求得对于一定条件的凝胶层析柱来说，只要通过实验得知某一组分的洗脱体积Ve，就可以计算出Kd值 以上关系可以通过图2表示Kd=l14.l15.四、Kd的几种判断 在凝胶柱层析过程中，Kd可以有以下几种情况：1.Kd=0时，Ve=Vo 对于完全不能进入凝胶内部的大分子(全排阻)，其洗脱体积就等于外水体积2.Kd=1时，Ve=Vo+Vi对于完全可以进入凝胶内部的小分子(全渗透)，其洗脱体积就等于外水体积和内水体积之和 l16. 由此可见，对于某一凝胶介质，如果在层析过程中有两种全排阻的大分子，即Kd=0，尽管它们在分子量之间的差别很大，但由于它们已经超出了该凝胶质的所能分离大分子的范畴，不可能有分离效果。
l17. 同样两种小分子全部都能进入凝胶颗粒内部空隙， Kd=1，尽管它们在分子量大小仍有差异，但由于它们已经超出了该凝胶质的所能分离小分子的范畴，同样也不可能有分离效果因此，不同型号的凝胶介质有不同的相对分子质量分离范畴在进行排阻层析之前，根据分离的相对分子质量选择合适的凝胶介质l18.3.0Kd1时，表示凝胶具有一定的吸附作用，此时VeVo+Vi例如某些芳香族化合物的洗脱体积远超出理论计算的最大值，这些化合物的Kd值一般都是大于1的如苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸在SephadexG-25中的Kd值分别为1.2、1.4和2.2l19. 在实际工作中，小分子不易得到Kd=1的数值，尤其是对交联度大的凝胶介质Kd差别较明显，如同样一个小分子在SphadexG-10柱层析测得的Kd是0.75左右，同样一个小分子在SphadexG-25柱层析测得的Kd是0.8左右l20. 造成这种差别的原因是由于一部分水分子与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部分，使凝胶的有效网状孔变小，小分子不能扩散和渗透到凝胶内部，是凝胶失去了部分筛分作用所致此时的Vi不能以凝胶的吸水量进行计算，因此，通常以小分子化合物通过凝胶柱来测定Vi值。
另外一种计算方法是不使用Vi和Kd，而是用Kav，(有效分配系数)代替Kd，定义如下l21. l22. 在这里实际上是将原来以水作为固定相(Vi)改为凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而洗脱剂(Ve-Vo)作为流动相Kav，和Kd值对交联度较小的凝胶介质差别不大，而对交联度大的凝胶介质差异较大 在排阻层析过程中，凝胶层析介质一般情况对流动相的组分无吸附作用，当流动相的体积Vt流过后，上样后的所有组分都应当被洗脱出来，这是凝胶排阻层析与其他的层析方法所不同之处l23.五、Ve与相对分子质量的关系 对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的相对分子质量有关，各种组分流过凝胶柱时，洗脱顺序按相对分子质量(Mr)的大小排列先后流出Ve与Mr的关系式如下 Ve=K1-K2lgMr (1-7)式中： K1-常数； K2-常数； Mr-相对分子质量； Ve-洗脱体积A-Sephadex G100;B-sephadex G-200l24. 有时Ve也可以用分离体积(Ve-Vo)、相对保留体积(Ve/Vo)、简化洗脱体积(VeVt)或有效分配系数(Kav)代替，它们与相对分子质量的关系与公式(1-7)相同，只是常数不同。
但实际操作过程中大多数都是以Kav对相对分子质量的对数(1gMr)作图，得到工作曲线，也称之为“选择曲线”，如图3所示 曲线的斜率是表明凝胶的性质，是一个重要的特征在凝胶允许的分离范围内，曲线的斜率越陡，分级分离的效果越好l25. 凝胶排阻层析分离主要决定于溶质中相对分子质量的大小和相应凝胶的交联度在同一类型的生物大分子(球形分子或线形分子)的前提下，凝胶分级分离的范围越窄，测定的相对分子质量越准确凝胶排阻层析具有设备简单、操作方便、重复性好、条件温和等优点，是实验室测定相对分子质量常用的方法，也是生物大分子分离纯化常用的分离手段l26.第三节凝胶层析介质 一、凝胶的基本性质 自然界天然凝胶和化学合成的凝胶种类很多，但能用排阻层析的凝胶则不多排阻层析的凝胶是一种球形颗粒，球内部是多孔网状结构与普通凝胶在性能上主要有以下几点区别l27.1.化学稳定性 合成凝胶的原料和合成凝胶介质以后所保留的化学基团(如羟基等)必须具有良好的惰性，不与待分离物质发生化学反应，不影响被分离物质原有的性质(如生物活性、构象等)；在比较苛刻的环境中(在偏碱或偏酸的溶液中和在高浓度的盐溶液中)不发生降解、变性反应，保持相对稳定。
2.无特异性吸附 凝胶颗粒上不存在或存在极少的离子基团，不与溶液中的离子化合物发生离子交换、吸附或亲和反应在低离子强度下，洗脱峰不出现拖尾现象，被分离物质有较高的回收率l28.3.具有较好的耐受性 凝胶颗粒对温度和有机溶剂具有较好的耐受性，尤其是对物理聚合的凝胶，在高温下(100左右)不发生熔融，在有机溶剂中凝胶的体积不发生收缩变形4.刚性好 凝胶颗粒具有一定机械强度，在允许的操作压范围内，柱床体积保持稳定，在层析的过程中流速不发生改变l29.二、凝胶层析介质的分类 目前，常用于排阻层析的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质1.葡聚糖凝胶层析介质 葡聚糖凝胶层析介质是由多聚葡聚糖通过与环氧氯丙烷交联而合成的，是一类具有网状结构的珠状凝胶颗粒葡聚糖凝胶交联的程度(简称交联度)与凝胶颗粒网状结构孔径的大小有直接关系，交联度越大，网状结构的孔径越小，分离的分子量就小；反之，交联度越小，网状结构的孔径越大，分离的分子量就大葡聚糖凝胶交联结构如图4l30.l31. 交联的葡聚糖不溶于有机溶剂和水的聚合物，但由于其结构中含有大量的羟基，又具有很强的亲水性，能迅速在水和电解质溶液中溶胀，在层析过程中非常容易与水溶性溶质接触。
合成的葡聚糖凝胶在酸性条件下糖苷键容易被水解，在碱性环境中比较稳定一般在0.25molL NaOH溶液中，60的条件下放置两个月以上仍不改变其原有的基本性质所以常用稀碱溶液处理葡聚糖凝胶层析介质，以除去残留在凝胶介质上的变性蛋白和其他杂质l32.l 在氧化剂的作用下葡聚糖凝胶上的羟基容易氧化成羧基，增加了带电荷基团，容易与溶液中的离子化合物发生交换反应，使其非特异性吸附的能力增强，从而影响分离效果和回收率葡聚糖凝胶对温度具有较好的耐受性，通常在溶胀状态的葡聚糖凝胶可以耐受110高温，而在未溶胀状态下的干胶可以耐受120 的高温l33. 最常用的葡聚糖凝胶层析介质是SephadexG 系列产品，它是由Pharmacia生产的，介质的型号不同，其交联度也不同，分离相对分子质量的范围有差异例如SephadexG-25、SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG-100、SephadexG-200等，代表着不同型号的葡聚糖凝胶，英文字母G后面的阿拉伯数字，表示凝胶吸水量不同型号的葡聚糖凝胶的有关技术参数见表-1l34.表-1 葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数凝胶型号 颗。