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1、抗阿尔茨海默病重组蛋白疫苗克隆、表达及免疫学鉴定作者：林洁，刘景晶，陈庆梅，施小明摘要目的:制备抗阿尔茨海默病的重组蛋白疫苗。方法: 将。淀粉样蛋白42肽N端表位AP115基因，通过来源于破 伤风毒素的辅助性T细胞表位多肽TTP基因片段，与大肠 杆菌L门冬酰胺酶II ( AnsB )基因的C末端融合，构建表达 质粒 pET28aAnsBTTPAp115o 转化至 E. coli BL21 , TBYE 培养基(Kanr )培养，乳糖诱导表达，通过渗透休克、 DEAE52cellulose 和 Sephadex G - 100 柱层析制备融合蛋 白rAnsBTTPApi15 ,通过酶活力和抗原性
2、测定鉴定融合蛋 白。结果:获得的融合蛋白rAnsBTTPApi15保留了 AnsB 71%的催化活力，具有与抗A|3142抗体特异性结合的能力。 结论:获得了在AnsB多聚酶分子表面呈现有Ap115表位的 融合蛋白rAnsBTTPAp115,为抗阿尔茨海默病疫苗研究奠定 了基础。关键词阿尔茨海默病；重组疫苗；表位；表面呈现；抗原性阿尔茨海默病（Alzheimers disease , AD ）是一种神 经退行性疾病1 ,缺乏行之有效的治疗方法2 神经病 理研究表明,6淀粉样蛋白42肽（AP142 ）的形成和聚集以及以其为核心形成的老年斑是AD发病的关键2 o用人Ap142肽免疫转基因小鼠模型引
3、发的针对Ap的自身免疫反应能有效减轻脑内Ap的沉积，阻止老年斑的形成,明显改 善记忆、认知和行为能力3 o其临床研究也显示出良好的 疗效，但有受试者出现中枢神经炎症状。Leverone等4 证明 N 端 15肽（A3115, DAEFRHDSGYEVHHQ 屋 A&142 的B细胞表位，以其作为免疫原能够避免全肽免疫导致的不 良反应,但是其免疫原性很弱，不利于诱导老年患者产生保 护性免疫反应。提高B细胞表位的免疫原性是AD疫苗设计 的关键5 o大肠杆菌L门冬酰胺酶II （ Lasparaginasell , Ans B）是由4个相同亚基组成的蛋白酶。我们曾用来源于 破伤风毒素的辅助性T细胞表位
4、多肽（tetanus toxin peptide,TTP; QYIKANSKFIGITELIYSYFPSVI ）作为空间连接肽将 人胆固醇脂转移蛋白C端的表位CETPC融合表达在AnsB 的C端下游，发现AnsB能够作为表位多肽的呈现载体6 本研究试图获得表面呈现有AP115的重组嵌合酶融合蛋白AnsBTTPAp115，利用AnsB的多聚化倾向7 和TTP的 免疫辅助功能来提高AP115的免疫原性，以期免疫后能够产生较强的体液免疫，进而达到安全有效防治AD的目的。1材料与方法 1.1材料质粒载体pET28aAnsBTTPCETPC为本室构建保存，pET28a购自TaKaRa公司；大肠杆菌BL2
5、1(DE3) 为本室保存；PCR纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自华 舜生物工程公司；DEAE52cellulose购自 Watman ;Sephadex G100为Pharmacia产品；兔抗A&115多克隆抗 体为Serotec产品:HRP标记的羊抗兔IgG二抗购自博士德 公司；各种限制性内切酶和连接酶均购自TaKaRa公司;AnsB纯品为本室制备保存；其他试剂均为进口分装或国产 分析纯。1.2表达载体的构建引物序列见表1。以质粒 pET28aAnsBTTPCETPC为PCR模板，使用上游引物p1 和下游引物pAp11521进行第1次加端PCR反应。循环条 件为:94C预变性 5min :
6、 94C变性 1min , 60C退火 1min , 72C延伸2min ,共30个循环；72C延伸10mino取5pl进 行琼脂糖电泳检测，然后用胶回收试剂盒回收，纯化获得相 应长度的PCR扩增片段；取和I作为第2次PCR加端扩增 的模板，用上游引物p1和下游引物PAP11522进行PCR反1!应,反应条件同上,试剂盒纯化产物,经Ncol/Hindlll双酶切,T4 DNA连接酶连接于经Ncol/Hindlll双酶切的pET28a表达载体,转化宿主BL21(DE3),由于融合蛋白保留了=1AnsB全基因，可以通过检测酶活力筛选重组子，测序鉴定阳性重组子。表1构建表达载体pET28aAnsBT
7、TPApi15使用的引 物（略）Tab 1 Primer design of constructs of pET28aAnsBTTPApi 15 plasmids1.3工程菌的诱导表达阳性克隆接种于含卡那霉素 50pgml-1的LB固体培养基上，37C培养16 h , 挑取单菌落接种于TBYE培养基（含1% tryptone, 0.5% yeast extract 和 0.5% NaCI,卡那霉素 50pgml-1 , 使用前加入葡萄糖至终浓度为0.2%）中，37C振摇培养 12-14 h，按1.2%比例接种到同样培养基中，30对振摇培养， 当OD600 nm 达到0.60.8时，加乳糖至终浓
8、度 5mmolL-1慢速诱导,并于诱导后1、3、5、7、9、 11、15h分别取培养菌液，定量检测AnsB酶活性，分析融 合蛋白rAnsBTTPApi15的表达情况。收集菌体。1.4融合蛋白的制备用蒸馅水悬浮洗涤新鲜菌体，离 心弃上清，加入渗透休克溶液l（ 0SI : 30mmolL-1 TrisHCI 含 1mmolL-1 EDTA 和 30%蔗糖）,充分悬浮菌体，室温下缓慢搅动20min,然后4对条件下离心弃 上清，加入渗透休克溶液II ( 0SII : 30mmolL-1TrisHCI , pH 8.0 ,含 1mmolL-1 EDTA ),在冰浴中缓慢搅拌10min，相同条件离心收集上
9、清。留样OSII休克 获得的上清液,15%SDSPAGE分析渗透休克情况。OSII处 理获得的上清液直接上DEAE52cellulose离子交换层析柱。用含有0350mmolL1 NaCI的平衡缓冲液梯度洗 脱。收集具有AnsB酶催化活力的洗脱峰，透析脱盐，冻干 浓缩。而后通过Sephadex G100分子筛凝胶层析进一步纯 化，最后收集具有AnsB酶催化活力的洗脱峰，透析，脱盐， 冻干，20对冷冻保存。15%SDSPAGE电泳检测制备的嵌 合酶 rAnsBTTPApi15o1.5融合蛋白的鉴定1.5.1AnsB酶活力测定样品稀释至1mgml-1 ,吸取5pl加入到1ml硼酸缓冲液和1ml反应
10、底物溶液（0.04mmolL-1 Lasaparagine ）的混 合体系中37C反应15min后 加入1ml的反应终止液（15% 三氯乙酸）终止反应。取0.5ml上述反应液与1ml Nessler混合液和3.5 ml蒸馆水混合，测定OD500 nm。对照标准曲线查算出酶活力,计算酶比活（IUmg1 *1.5.2抗原性检测 用已获得的融合蛋白作为包被抗原，用含2%BSA的PBS （ pH 7.4 ）溶液按1:100比例稀释 兔抗Ap142抗体作为一抗，以HRP标记的羊抗小鼠IgG为 二抗，采用间接ELISA法检测每孔的OD450 nmo同时设置 生理盐水（NS ）和AnsB对照组。2结果2.1
11、表达载体pET28aAnsBTTPAp115的构建 测序鉴 定表明表达载体构建成功。此表达载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）指导融合蛋白rAnsBTTPApi15的表达（图1 *2.2融合蛋白的表达和纯化加入乳糖诱导后取样测算酶比活，结果表明诱导8-1 Oh后有酶活性的融合蛋白 rAnsBTTPA|3115表达量达到最高（图2 * SDSPAGE结果 显示OSII休克菌体沉淀获得的上清液中含有大量的目的融 合蛋白，酶活力检测显示具有AnsB活力，表明表达的嵌合 酶rAnsBTTPAp115能够定位分泌到周质腔中,进而折叠成具有酶活力的可溶性嵌合酶。经离子交换树脂和分子筛凝 胶,获得了纯化的r
12、AnsBTTPApi15 （图3 ）b2.3融合蛋白的AnsB酶活力测定定量检测酶活力，结 果显示AnsB酶比活为240 IUmg-1 ,嵌合酶 rAnsBTTPAp115 酶比活约为 170 IUmg-1 ,保持 了 71%的酶活力。2.4融合蛋白抗原性验证结果ELISA结果显小,融合 蛋白在体外能够与抗AP142抗体特异性结合（图4 ）b结果 表明，融合蛋白能够将Ap115呈现在AnsB的多聚酶分子表 面，并且保留了表位原有的可及性和免疫反应性。图1表达载体pET28aAnsBTTPA3115模式图（略）Fig 1 Construction schematic presentation o
13、f thefusion enzyme of AnsBTTPApi15.rAnsBTTPApi15 fusion protein was expressed in E. coli using the pET28a vector under the direction of the T7 promoter. The T7 promoter is represented in black arrowhead box, the AnsB gene is represented by black points box, the tetanus toxin 831 854 fragments (TTP)
14、is represented in black box, and the AP115 gene is represented by opened box. In addition, the TTP, linker and the AP115 are represented by singleletter codes.图2嵌合酶表达曲线（略）Fig 2 Expression curve of E.ColiBL21/pET28aAnsBTTPApi15图3嵌合酶AnsBTTPAp115的表达和纯化（略）Fig 3 Expression and purification of fusion enzy
15、me of AnsBTTPApi15.Periplasm expression and purification of AnsBTTPApi15 were analyzed in 15% SDSPAGE gel stained with Coomassie blue. Lane 1. Molecular weight markers; Lane 2. Total cell proteins of E. coli BL21 (DE3) induced by lactose; Lane 3. Total cell proteins of E. coli BL21 (DE3) containing pET28 - AnsBTTPApi15 induced by lactose; Lane 4. The supernatant of osmoticsolutionll released from the periplasm of the bacteria; Lane 5.Purified rAnsBTTPApi15; Lane 6. native Lasparaginase B.图4融合蛋白抗原性鉴定（略）Fig 4 Antige
