第七章 代谢物酶法分析技术,教学目标与要求,掌握：代谢物酶法分析的概念，平衡法和速率法的测定的理论基础，脱氢酶指示系统和过氧化物酶指示系统及酶循环法测定的方法原理与评价 熟悉：酶激活和酶抑制测定法方法原理与评价 了解：试剂酶的质量要求，代谢物酶法分析技术的发展前景,6,试剂酶的质量要求,7,小结与展望,目录,酶法分析（enzymatic method）是以酶促反应为基础，酶作为主要试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂，以及酶偶联法测定酶活性等的一类方法 代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术酶 法 分 析,酶活性单位 1、惯用单位 :由发明者自行命名，结果无可比性；（20世纪50年代）. 2、国际单位 : 在特定条件下，1分钟能转化1微摩尔底物（mol/ min）的酶量为一个“国际单位” ：（ 76年）; 63年是25及最适条件下. 3、Katal单位：在规定条件下，即每秒钟转化1个摩尔底物（mol /s）的酶量.,定时法： 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（dS/min）或产物生成速度（dP/min），将速度换算为mol/ min便是以国际单位表示的酶活性,连续监测法： 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，每隔一定时间（2s60s）连续测定酶促反应过程中某一底物或产物的特征信号的变化，从而计算出每分钟的信号变化速率。
连续监测法是在多个时间点连续测定产物生成量或底物消耗量，选取线性期的速率来计算酶活性，又称速率法临床诊断MI的常用生化标志物血中浓度动态变化趋势,临床常用的诊断急性心肌梗死常用标志物一览表,肝脏疾病的三酶过筛试验（13000） ALT增高肝实质细胞损伤;（83%） GGT增高胆汁淤积和对肝的诱导作用;（95%） ChE 降低肝脏的蛋白合成能力是判断肝脏疾病预后一个良好指标74%） 合计（99%） AST：71%、ALP：60%、LDH：34%,血清 酶浓度在pgng水平， 化学检测浓度约mg ug水平 酶测定方法 1绝对定量法：测定酶分子的绝对数量 2相对定量法：测定酶分子的相对数量 （临床生化介绍） 相对定量法测定酶活性的依据： 质量作用定律测定方法 1、量气法：操作繁琐，灵敏度低，少用 2、比色法与分光光度法 比 色 法：操作繁，技术要求高，灵敏度低，中止反应 分光光度法：测定范围广，灵敏度较高，不需停止反应不作标准曲线， 可倒入酶偶联技术 3、荧光法和同位素法（放射性核素法） 优点：灵敏度高，可提高23个数量级，人工合成底物 不足：技术掌握较难，试剂仪器要求高，易产生非特异性荧光干扰测定。
4、其它方法： 离子选择电极法，旋光法、极谱法、高效液相色谱法工具酶：作为试剂用于测定物质浓度或酶浓度的酶 酶学分析方法内容： 借助酶测定某化合物的浓度、借助酶测定另一种酶活力 酶学分析类型 1代谢物浓度的测定 1）终点法 2）动力学法：零级反应及一级反应； 2血清酶测定 动力学法 : 零级反应及一级反应；,特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析 代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法血糖测定）,酶法分析的主要优点,代谢物酶法分析,平衡法?（终点法） 速率法（动力学法）,第一节 代谢物酶法分析的原理,平衡法是指标本中待测物的量有限，经过酶促反应逐渐被消耗，当剩余的底物量很小（1%5%）时，指示反应信号逐渐达到稳定，即通常所说的终点；所以又称为终点法(end-point method)平衡法的特点是测定底物的总变化量， 即测定的是“浓度”1、 平衡法测定的理论基础-终点法,一、平衡法,积分得：,米氏方程,改写为,式中S0为待测物，St为待测物至反应t时间后的浓度,若反应达到平衡，假设 ， 即 S0St S0，,以上积分式：,则可简化为：,说明达到平衡所需的时间与Km、Vmax、S0有关，Km越小、Vmax越大（加入酶量越多）、S0越小（待测物越少）则达到平衡所需的时间越短。
若 S0 Km,积分得：,可简化为：,若同时做标准管，不管反应到达何种程度，只要标准管与测定管反应时间（t）一致，则有：,标准管的 S0St 与待测管的 S0St 分别代表消耗量，也代表转化为产物的量，可以用产物的吸光度来表示（As和Au）标准管的S0与测定管的S0分别表示为Cs和Cu可简化为：,当 S0St S0，即反应基本达到平衡，Au和As基本稳定不变，此时测定误差最小如果存在基质效应，两者反应程度不一，若按上式计算就会带来误差此式是平衡法测定代谢物的基本原理,此公式成立是前提条件,在保证测定线性的前提下，Km要尽量小 酶用量要足够大，以保证反应能在可接受的较短的时间（一般为13 min）达到终点（平衡），以保证有较快的反应速度完成测定 反应应朝正反应方向进行，如果反应的平衡常数太低，可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH 等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定2. 定时法（平衡法）设计的基本条件,定时法概念 将酶与底物在特定条件（缓冲液、温度等）下孵育，经过一定时间后，用终止液终止反应，通过化学或生物化学的方法测出底物或产物的总变化量，除以时间即可计算出底物消耗速度（dS/min）或产物生成速度（dP/min），将速度换算为mol/ min便是以国际单位表示的酶活性。
在临床操作中，只要测定期间待测物消耗 5%，只要测定两个固定时间的吸光度差值，就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度，这种方法又称为固定时间法(fixed assay)定时法(终点法),速率法(rate assay)又称动力学法，测定的是速度（通常指的是初速度），依据是当底物的消耗量较小时(5%)，酶促反应呈一级反应，此时的反应速度（v）与代测物的浓度成正比例速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应,1. 速率法测定的理论基础,二、速率法,根据米氏方程：,当S Km，则S + Km Km,当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度Vmax也不变,符合一级酶促反应,米氏方程改为：,若同时带标准管，则有：,标准管的S0与测定管的S0分别表示为Cs和Cu，速度用 A/min来表示上式改写为：,速率法测定代谢物浓度的原理,前提条件是测定初速度越偏离初速度，测定误差则越大,根据米氏方程：,当S Km，则S + Km S,当酶量固定不变时，酶促反应的 最大速度Vmax也不变,符合零级酶促反应,米氏方程改为：,v V max,为了保证有足够的测定线性和较长的反应动态期，所用酶的 Km 应足够大 酶用量要合适，用多了浪费，用少了可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失。
速率法测定误差较大，酶促反应速度受很多因素影响，只有在各种因素很好控制的前提下，反应速度（v）才与代测物的浓度成正比例2.速率法设计的基本条件,与平衡法测定比较，速率法具有很多优点： 因测定时间短，检测速度快，不需把所有底物转化为产物，酶用量比平衡法小，检测成本低 速率法一般不需做样品空白，标本本身因素影响小平衡法若要将代测物在较短时间内消耗接近完全，必须使用大量的酶但其优点是试剂酶活性的下降对测定结果影响远没有速率法明显，仅使达到平衡所需时间延长，检测范围变窄3、 定时法（平衡法）与速率法的反应特性,终点法的开始一段时间都有可能遵循一级反应规律相反，速率法只要时间足够长，也会达到平衡对于终点法来说关键是确定达到终点所需的时间对于速率法来说关键是如何使酶促反应成一级反应酶作用的特异性高，血清等体液样品不需预处理就能测定，简化了实验程序； 试剂酶大多是蛋白质，没有毒性，避免了化学品对环境的污染； 酶促反应温和，制成试剂盒可适用于自动分析代谢物酶法分析主要优点,代谢物酶法分析在准确性、精密度、灵敏度和线性测定范围等方面都优于传统的化学法,速率法和终点法（平衡法）测定比较,终点法的试剂酶活性下降对测定影响远没有速率法明显，仅使达到终点所需时间延长，检测范围变窄。
但对速率法是致命的，可能导致线性期缩短，甚至一级反应丧失由于以上种种原因，代谢物酶法分析大多选择终点法待测物与产物在理化性质上有便于检测的信号，如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身特征性的吸收峰的改变来进行定量分析的方法称为直接法通过测定酶促反应前后某特定波长下的吸光度变化与待测物浓度成正比例该法设计简单，根据底物不同分为单底物反应和双底物反应第二节 单酶反应直接法,一、单底物反应测定法,尿酸 + O2 + H2O,尿囊素 + CO2 + H2O2,胆绿素+ H2O,胆红素 + O2,尿酸在293 nm 处有吸收，而尿囊素没有吸收，在293 nm 处测定吸光度下降胆红素在450nm处有吸收，而胆绿素没有吸收，在450nm处测定吸光度下降尿酸紫外法测定,胆红素测定,二、双底物反应测定法,对于双底物反应，为了便于实验分析，在实验设计时一般将所加的另一种底物浓度设计得相当大，即S2 Km2，这时的酶促反应动力学可按单底物法处理，整个反应只与待测物有关，呈一级反应动力学但在以NADH 或NADPH 为底物的终点法测定中，因340 nm 吸光度的限制，辅酶的用量不可能过高 在340 nm 处测定吸光度的增加来进行定量的方法。
乳酸测定,乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,丙酮酸测定,在340 nm 处测定吸光度的下降来进行定量的方法乳酸 + NAD+,丙酮酸 + NADH + H+,体内还有很多代谢物如酮体、乙醇、碳酸氢根等都可以直接测定，关键是需要相对应的酶酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的组分，将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中，从而达到检测目的的方法称酶偶联法最常用的偶联指示系统有两个：一个是脱氢酶指示系统，另一个为过氧化物酶指示系统第三节 酶偶联法,一、脱氢酶指示系统测定法,氧化型辅酶NAD(P)+ 在340 nm 处没有吸 收峰, 还原型辅酶 NAD(P)H在340 nm 处有吸收峰以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+) 或氧化型辅酶(NADP+)变为还原型NAD(P)H后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被测物的浓度，也可利用脱氢酶的逆反应，将还原型NAD(P)H 变为氧化型NAD(P)+，测定340 nm 处吸光度的下降来计算被测物的浓度一、脱氢酶指示系统测定法,脱氢酶指示系统,血清葡萄糖己糖激酶法测定,Glu + ATP,G-6-P+ADP,G-6-P + NADP+,P-6-GA + NADPH + H+,指示酶反应将NADP+转化为NADPH + H+，测定340 nm吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比,41,脱氢酶指示系统,血清尿素测定,尿素 + H2O,2NH3 + CO2,NH3 + -酮戊二酸 + NADH + H+,谷氨酸 + H2O + NAD+,测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正比，可以用速率法测定；也可以用平衡法测定 。
唾液酸酶法测定,唾液酸酶法（速率法）测定：唾液酸（SA）在神经氨酸苷酶（NA）的作用下生成N-乙酰神经氨酸（NANA），进一步在NANA-缩醛酶的作用下生成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺丙酮酸在NADH存在下由LD作用下生成乳酸和NAD+，测定340nm处吸光度下降的速率，从而得出样品中唾液酸的含量SA,NANA,NANA,丙酮酸 + N-乙酰甘露糖胺,丙酮酸+ NADH + H+,乳酸 + NAD+,脱氢酶共用辅酶系统，相互干扰严重，虽然体内相对应的底物含量低，但在不同病理情况下，其干扰程度不确定 灵敏度低，有时靠一次脱氢反应不能测定含量较低。