第二节 甲基化酶 Methylase Methylationmethyltransferase原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割 一、DNA甲基化酶甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开真核生物中目前只发现5-甲基胞嘧啶（M5C）M5C占整个胞嘧啶中的27%（果蝇和某些昆虫例外）M5C大多以M5CpG的形式存在，不同物种或同一物种的不同组织中，M5C出现的频率也不尽相同如果有一个DNA片段，有Ava的3个识别顺序，当用Ava处理后可得4个片段可是，如果先用Taq甲基化酶和Hpa甲基化酶使DNA顺序中的有些碱基甲基化，然后再用Ava去切，结果只有1个识别顺序可被Ava作用，只产生2个DNA片段二、甲基化酶的种类在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶，在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶1.Dam甲基化酶DNA Adenine methylaseGATC 腺嘌呤N6位置 引入甲基 PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 识别 位点中含GATC序列 ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16) 部分部分识别识别识别识别 序列含序列含GATCGATC序列序列4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列有些限制酶对对Dam甲基化敏感不能切割相不能切割相应应的序列的序列 如如:Bcl:BclI, I, ClaClaI, I, MboMboI, I, XbaXbaI I 等等这这; ;甲基化甲基化敏感的限制性内切敏感的限制性内切酶酶. . 不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等.Mbo 和 Sau3A 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。
一般哺乳动动物DNA 不会在A-N6上甲基化 当需要在敏感位点上完全切割当需要在敏感位点上完全切割DNADNA时时时时，必必须须须须从从damdam- - E.coliE.coli中提取中提取DNADNA2. 2.DcmDcm甲基化甲基化酶酶1.1. DNA cytsine methylaseDNA cytsine methylase 识别识别 CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基EcoRII / BstNI CCA(T)GG CCA(T)GG 二者二者识别识别识别识别 序列相同，但切点不同序列相同，但切点不同EcoRII受dcm甲基化作用影响 BstNI可避免这这一影响受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCCEcoRII EaeI 等不受影响酶有： KpnI GGTACCBanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC等3. EcoKI甲基化酶识别 AAC(N)6GTGC TTG(N)6CACG A N6位置 但识别 位点少(1/8kb) 研究较少 而dam（1/256bp） dcm(1/512bp)4. SssI甲基化酶来自原核生物SpiroplasmaCG序列中的C在C5位置上甲基化可在未甲基化或半甲基化链上起作用许多酶对此甲基化敏感 AatII ClaI XhoI SalI等 不敏感的有BamHI EcoRI SphI KpnISssI甲基化的DNA 受E.coli McrA, McrBC, Mrr 系统的限制5. 其它甲基化酶DNMT1 1988年克隆出的真核生物的甲基转移酶.具有催化作用的c端和调节功能的N端.三、依赖于甲基化的限制系统 E.coli中至少有3种依赖于甲基化的限制系统 它们识别的序列各不相同， 但只识别经过甲基化的序列依赖于甲基化的内切酶mcrA, mcrBC, mrr 都限制由 CG甲基化酶(MSssI)作用的DNA Mrr也限制m6A McrBC 切割两套位点（G/A）mC，这两套位点之间间 隔2kb，最适为55103bp，需GTP大多数常用的E.coli受体都含这三个限制系统 三个都不限制Dam, EcoKI , EcoRI修饰的位点 McrA限制HpaII(CCGG)甲基化修饰的位点四、甲基化对限制性内切酶酶切的影响1. 修饰酶切位点 HincII GTCGAC GTCAAC GTTGAC GTTAAC M.TaqI甲基化TCGA中的A，所以M.TaqI处理DNA后，GTCGAC将不受HincII切割 BamHI GGATCC M.MspI m5CCGG如果BamHI前面为CC或后面为GG， 那么M.MspI处理的DNA抵抗BamHI的切割 构建DNA文库时用AluI(AGCT)和HaeIII(GGCC)部分消化基因组DNA 用M.EcoRI甲基化酶处理， 然后加上合成的EcoRI接头 当再用EcoRI来切割时只有接头上的位点可被切割2. 产生新酶切位点TCGATCGA AGCTAGCT TaqI TaqI M.TaqI TCGA*TCGA* *AGCT*AGCT DpnI3. 用于研究细胞DNA中位点特异性甲基化的水平及分布 哺乳动物m5CG、植物的m5CG，m5CNG 肠道细胞的Gm6ATC C m5/4 CGG MspI可切割，HpaII不可切割Gm6ATC Sau3AI 可切割，MobI不可切割 其它4. 对基因组作图的影响在哺乳动物DNA CpG序列出现的频率大约只有预计 的1/5 含CpG序列的识别 序列极其稀少大多数CpG都发生甲基化 含CpG的所有识别 序列的酶不能切割思考题：某DNA序列中存在酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现酶切不动，试分析可能原因？。