第一节 紫外-可见分光光度法 第二节 薄层色谱扫描法 第三节 高效液相色谱法 第四节 气相色谱法 第五节 浸出物测定法 第六节 挥发油测定法 第七节 容量分析法,第六章 中药制剂的含量测定技术,高晓波、纪从兰老师编写,1. 定义 紫外-可见分光光度法（Ultraviolet and Visible Spectrophotometry）系指通过测定被测物质在紫外-可见光区(200～760nm)对光的吸光度或发光强度，进行物质定性定量分析的方法2. 特点 设备简单、操作简便、灵敏度和准确度较高等 3. 适用范围 中药制剂定性鉴别、杂质检查及含量测定第一节 紫外—可见分光光度法,一、仪器工作原理 （一）紫外-可见分光光度仪的构造,第一节 紫外—可见分光光度法,数据 处理 系统,第一节 紫外—可见分光光度法,1. 光源（辐射源) （1）可见光光源：为热辐射光源，如卤钨灯、碘钨灯、钨丝灯 （白炽灯） （2）紫外光源：多为气体放电光源，如氢、氘、氙放电灯及汞 灯等 2. 单色器 是能从光源的复合光中分出测量所需波长单色光的光学装置 （1）棱镜单色器：有玻璃和石英两种材料是依据光的折射率不同，而将其分成不同波长的单色光。
第一节 紫外—可见分光光度法,（2）光栅单色器：是利用光的衍射和干涉作用制成的可用于紫外、可见和近红外光谱区域，具有良好的、几乎均匀一致的色散率，且具有适用波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制作等优点，是目前常用的色散元件缺点是各级光谱会重叠而产生干扰3. 吸收池 又叫比色皿是用于盛放分析试液并提供一定吸光厚度的器皿一台分光光度计配有几组厚度不同的吸收池，吸收池的大小规格从几毫米到几厘米不等，最常用的是1厘米的吸收池 （1）石英池：适用于可见光区及紫外光区 （2）玻璃吸收池：只能用于可见光区第一节 紫外—可见分光光度法,4.检测器 是通过光电转换元件检测透过光的光通量大小，并将光信号转变成电信号的装置 检测器应在测量的光谱范围内具有高的灵敏度；线性关系好、线性范围宽；对不同波长的辐射响应性能相同且可靠；有好的稳定性和低的噪音水平等特点 （1）光电池：常用的光电池有硒电池和硅光电池 （2）光电管：它以一弯成半圆柱且内表面涂上一层光敏材料的镍片作为阴极，而置于圆柱形中心的一金属丝作为阳极，密封于高真空的玻璃或石英中构成的，当光照到阴极的光敏材料时，阴极发射出电子，被阳极收集而产生光电流。
真空光电二极管,第一节 紫外—可见分光光度法,（3）光电倍增管：光电倍增管是一种加上多级倍增电极的光电管，其外壳由玻璃或石英制成，阴极表面涂上光敏物质，在阴极、阳极间装有一系列次级电子发射极，D1、D2……等光电倍增管工作原理图,第一节 紫外—可见分光光度法,5. 信号指示系统 是把检测到的信号以适当的方式显示或记录下来常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等常用的显示方式有数字显示、荧光屏显示、曲线扫描及结果打印等多种高性能的仪器还带有数据站，即可对分光光度计进行操作控制，又可进行数据处理二）紫外-可见分光光度计的工作原理,第一节 紫外—可见分光光度法,1. 单光束分光光度计的工作原理 国产722型、751 型、724型、英国SP500型以及Backman DU-8型等均属于此类光度计光学系统工作原理图,第一节 紫外—可见分光光度法,单波长双光束分光光度计原理图,2. 单波长双光束分光光度计的工作原理 仪器有国产710型、730型、740型等第一节 紫外—可见分光光度法,3. 双波长分光光度计的工作原理 紫外分光光度计（200～400nm）、可见分光光度计（400～800nm）和紫外-可见分光光度计（200～1000nm）。
双波长分光光度计光路示意图,二、仪器操作通法 （一）操作通法,第一节 紫外—可见分光光度法,1. 仪器接通电源，预热 2. 根据测定波长，选择相应光源，继续预热（各型号仪器在操作顺序上略有区别） 3. 灵敏度钮置1档 4. 将盛有供试品溶液及空白（参比）溶液的吸收池放入吸收池架，使空白（参比）溶液置光路位置，盖好供试品室盖 5. 量程选择钮置T位置第一节 紫外—可见分光光度法,6. 断开光路调节仪器零点，使显示为0打开光路调节仪器透光率，使显示为100% 7. 量程选择钮置A位置 8. 将供试品置于光路中，读取供试品的吸光度值 9. 仪器使用完毕，取出吸收池，关机，登记 10. 不同型号的紫外分光光度计其操作方法和要求亦有所不同，使用前应详细阅读使用说明书二）注意事项,第一节 紫外—可见分光光度法,1. 量瓶、移液管及吸收池 均应经洗净、校正后使用 2. 吸收池的校正 3. 吸收池使用方法 ①使用前的处理；②吸收池使用；③使用后的处理 4. 狭缝宽度的选择 5. 吸光度的测定 6. 制剂含量的测定,三、含量测定 （一）基本原理,第一节 紫外—可见分光光度法,紫外-可见分光光度法的定量分析依据是朗伯-比尔定律。
数学表达式为：A=KCL A为吸光度；K为吸收系数；C为溶液浓度；L为液层厚度 吸收系数：百分吸收系数、摩尔吸收系数 《中国药典》采用百分吸收系数二）操作步骤,第一节 紫外—可见分光光度法,1. 对照溶液品与供试品溶液的制备 2. 紫外可见分光光度计的校正 （1）波长准确度的校正,吸光度准确度的标准范围,第一节 紫外—可见分光光度法,（2）吸光度的校正,铬酸钾溶液的吸光度,第一节 紫外—可见分光光度法,（3）杂散光的检查,杂散光的检查,第一节 紫外—可见分光光度法,3. 选择测量条件 显色反应的条件、消除干扰物质的方法、测量波长、参比溶液、及测量波长、吸光度范围及仪器狭缝宽度的选择 4. 进样测试 5. 含量计算,（三）含量测定的方法,第一节 紫外—可见分光光度法,1. 单组分样品的定量分析 （1）吸收系数法：按药品标准规定的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度（A），根据A=K·C·L与药品标准规定的被测物质的百分吸收系数， 计算供试品溶液的浓度C供（g/100ml） 含量（W/W）=C供×D供×V样100×W供,第一节 紫外—可见分光光度法,如《中国药典》驻车丸中总生物碱的含量测定、前列舒丸中牡丹皮的含量测定等采用本法。
先计算C供，再计算出药品中被测成分的含量（W/W）含量计算公式有两种： ①含量（mg/丸）=C供（mg/ml)×D供×V样(ml)×平均丸重（g/丸）W样（g） ②含量（标示量%）=C供（mg/ml)×D供×V样(ml)×平均丸重（g/丸）W样（g)×标示含量（mg/丸）×100%,第一节 紫外—可见分光光度法,（2）对照品比较法：按药品标准的规定，在相同条件下，在规定波长处分别测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度，按 计算供试品溶液中待测组分的浓度 式中：AR为对照品溶液的吸光度；AX为供试品溶液的吸光度；CR为对照品溶液的浓度；CX为供试品溶液的浓度 《中国药典》华山参片中生物碱的含量测定、黄杨宁片中环维黄杨星D的含量测定均采用本法第一节 紫外—可见分光光度法,（3）标准曲线法（工作曲线法）：配制一系列不同浓度的对照品溶液，选择合适的参比溶液，在相同条件下分别测定各对照品溶液的吸光度以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制A-C曲线，称为标准曲线或工作曲线然后在完全相同的条件下测定样品溶液的吸光度，从标准曲线(或回归直线)上查出样品溶液的对应浓度，或代入回归方程，求出样品溶液的浓度。
标准曲线,第一节 紫外—可见分光光度法,在做精密测量时，用对照品溶液的浓度进行线性回归，求出回归直线方程（相关系数r≥0.999），绘出回归直线代替标准曲线，以尽量消除偶然误差 亦可利用计算器将一系列对照品溶液的浓度与相应的吸光度进行一元线性回归，求出回归方程（相关系数≥0.9990），将供试品溶液的吸光度代入回归方程，算出供试品溶液的浓度回归方程：A=a+bC 式中，A为被测溶液吸光度；C为被测溶液浓（g/ml）；a为截距；b为斜率 《中国药典》槐米中芦丁及青黛中靛蓝的含量测定，复方皂矾丸中的硫酸亚铁，独一味胶囊、益心酮片、消咳喘糖浆和排石颗粒中的总黄酮，桂林西瓜霜中的总生物碱的含量测定等均使用该法第一节 紫外—可见分光光度法,2. 混合物的测定方法 当待测组分彼此不发生化学反应时，根据吸收定律的加和性，不需化学分离，可同时测定样品中两种或多种组分的含量 当溶液中同时存在两组分a和b时，它们的吸收峰相互重叠的程度有三种情况，如图所示混合组份吸收光谱重叠示意图,第一节 紫外—可见分光光度法,（1）在最大吸收峰处互不重叠：如图 (1)，可分别在λ1和λ2处用单组分样品的测定方法，先后测定组分a和b的浓度。
（2）在最大吸收峰处部分重叠：如图 (2)，在λ1处，组分b无吸收，在λ2处，组分a和b均有吸收则可先在λ1处用单组分样品的测量方法，测定样品溶液中组分a的浓度；然后在λ2处测定样品溶液的吸光度Aa＋b2，根据吸光度的加和性原则，计算组分b的浓度 （3）两组分在最大吸收峰处相互重叠：如图 (3)，常采用解线性方程组法选择两个测定波长λ1和λ2，首先测定两组分在两波长处的吸收系数的值，然后在两波长处测定样品溶液的吸光度，最后用解线性方程组的方法求出两组分的浓度第一节 紫外—可见分光光度法,（4）等吸收双波长测定法：对于图 (3)的情况，可利用等吸收双波长测定法对其中一种组分或两种组分同时进行测定操作步骤：①选择参比与测定波长；②绘制标准曲线；③含量测定,等吸收双波长测定法示意图,第一节 紫外—可见分光光度法,（5）导数光谱法：导数光谱法又称微分光谱法，是一种消除光谱干扰的方法以吸光度A对波长λ的吸收光谱称为零阶光谱，对吸收光谱进行一级微分，即可得到(dA/dλ)-λ曲线，称为一阶导数光谱，以同样方法可得到二阶导数光谱(d2A/dλ2)-λ曲线，三阶导数光谱(d3A/dλ3)-λ曲线，四阶导数光谱(d4A/dλ4)-λ曲线。
各阶倒数光谱的基本曲线图 1.零阶 2.一阶 3.二阶 4.三阶 5.四阶,第一节 紫外—可见分光光度法,原理：在导数光谱中，导数信号与浓度成正比，即：dA/dλ∝C，d2A/dλ2∝C，d3A/dλ3∝C，d4A/dλ4∝C信号对浓度的灵敏度取决于吸收系数在特定波长下的变化率，即：dε/dλ，d2ε/dλ2， d3ε/dλ3， d4ε/dλ4，导数光谱的测量法有几何法和代数法在几何法中，导数光谱的定量参数是振幅 导数光谱的微分阶数n越大，峰形越尖锐、分辨率越强，但信噪比将降低，通常不超过四阶操作步骤：①干扰情况考查；②选择测定条件；③绘制标准曲线；④样品测定第一节 紫外—可见分光光度法,（6）差示光谱法(ΔA)法：先选定一个理想的参比溶液，使待测组分发生特征光谱变化，而共存组分不发生光谱变化，由此消除其干扰一般是取两份相等的供试液，在一份中加酸或碱，形成不同的酸碱介质环境；或加入能与待测组分发生反应的试剂，使待测组分以不同的形式存在，吸收光谱发生显著变化，将两份供试液稀释至同样浓度，分别置于样品池与参比池中，于选定波长处测其吸光度差值ΔA，在一定浓度范围内，ΔA与待测组分浓度C呈线性关系，可作为物质定量分析的依据。
第一节 紫外—可见分光光度法,原理：导数光谱的微分阶数n越大，峰形越尖锐、分辨率越强，但信噪比将降低，通常不超过四阶导数光谱的波长间隔△λ越大，灵敏度越高，但分辨率降低一般选1～2nm为宜导数光谱的中间波长λm的选择原则是：干扰组分在此波长处的导数值最好为零，而且通过选择适宜的波长和求导条件，可消除背景吸收、杂质和共存物的干扰操作步骤：①干扰情况考查；②选择测定条件；③绘制标准曲线；④供试品测定；,四、案例 （一）六味地黄颗粒中牡丹皮的含量测定,第一节 紫外—可见分光光度法,取本品约2g。