制作人：王丹丹高中生物、选修一、生物技术实践（人教版）专题：传统发酵技术的应用课题3：泡菜并检测亚硝酸盐的含量泡菜是一种以湿态发酵方式加工制成的浸制品，为泡酸菜类的一种泡菜制作容易，成本低廉，营养卫生，风味可口，利于贮存目前较受欢迎的是川味和韩味泡菜，在许多风味餐馆里，都有其踪影，它鲜嫩清脆，可以增进食欲，帮助消化与吸收一、泡菜制作的微生物一、泡菜制作的微生物 （1 1）乳酸菌）乳酸菌 分布常见的有常见的有乳酸链球菌乳酸链球菌和和乳酸杆菌乳酸杆菌（用于制作酸奶）用于制作酸奶）种类空气、土壤空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有分布作用在无氧条件下，将葡萄糖分解成乳酸类型异养厌氧型异养厌氧型细菌细菌（2 2）假丝酵母）假丝酵母作用发酵初期较为活跃，消耗氧气，产生有机酸形成发酵初期较为活跃，消耗氧气，产生有机酸形成厌氧，酸性环境厌氧，酸性环境，为乳酸菌繁殖奠定基础为乳酸菌繁殖奠定基础C6H12O6CHO（3 3）腌制条件）腌制条件腌制过程中，要注意控制腌制的腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度时间、温度和食盐的用量和食盐的用量温度过高、食盐用量不足温度过高、食盐用量不足1010、腌制时间、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。
量增加一般在腌制一般在腌制1010天后，亚硝酸盐的天后，亚硝酸盐的含量开始下降含量开始下降泡菜坛本身质地好坏对泡菜与泡菜盐水有泡菜坛本身质地好坏对泡菜与泡菜盐水有直接影响，故用于泡菜的坛子应经严格检直接影响，故用于泡菜的坛子应经严格检验，其优劣的区分方法如下：验，其优劣的区分方法如下： 观型体观型体: :泡菜坛以火候老、釉质好、无裂泡菜坛以火候老、釉质好、无裂纹、无砂眼、形体美观的为佳纹、无砂眼、形体美观的为佳 看内壁看内壁: :将坛压在水内，看内壁，以无砂将坛压在水内，看内壁，以无砂眼、无裂纹、无渗水现象的为佳眼、无裂纹、无渗水现象的为佳 视吸水视吸水: :坛沿掺入清水一半，用废纸一卷坛沿掺入清水一半，用废纸一卷，点燃后放坛内，盖上坛盖，能把沿内水吸干，点燃后放坛内，盖上坛盖，能把沿内水吸干（从坛沿吸入坛盖内壁）的泡菜坛质量较好，（从坛沿吸入坛盖内壁）的泡菜坛质量较好，反之则差反之则差 听声音听声音: :用手击坛，听其声，钢音的质量用手击坛，听其声，钢音的质量则好，空响、砂响、音破的质次则好，空响、砂响、音破的质次2、设备及用品（1 1）泡菜罐、菜刀、菜板泡菜罐、菜刀、菜板（2 2）将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。
将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次3 3）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，）将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛，混合均匀如果希望发酵快些，可将蔬菜在开混合均匀如果希望发酵快些，可将蔬菜在开水中浸水中浸1 1分钟后入坛，再加上一些白酒分钟后入坛，再加上一些白酒4 4）将坛口用水封好，防止外界空气进入将坛口用水封好，防止外界空气进入5 5）泡菜发酵）泡菜发酵发酵前期：发酵前期：蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要主要是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行是以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡从水槽内放出，二氧化碳以气泡从水槽内放出，逐渐使坛内形成嫌气状态逐渐使坛内形成嫌气状态发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、发酵产物中除乳酸外，还有其他，如乙醇、CO2CO2等称异型乳酸发酵等称异型乳酸发酵发酵中期：发酵中期：由于前期乳酸的积累，由于前期乳酸的积累，pHpH下降下降，嫌气状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃，嫌气状态的形成，乳酸杆菌活跃进行活跃的同型乳酸发酵，乳酸积累的同型乳酸发酵，乳酸积累pHpH达达3.53.8.3.53.8.大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制大肠杆菌、酵母菌、霉菌等的活动受到抑制。
这一期为完全成熟阶段，泡菜有酸味且清这一期为完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香品质最好香品质最好发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵发酵产物中只有乳酸，称为同型乳酸发酵发酵后期：发酵后期：继续进行乳酸发酵继续进行乳酸发酵，乳酸积累，乳酸积累达达1.21.2以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制以上时，乳酸杆菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止发酵速度逐渐变缓甚至停止腌制腌制1 1周左右即可开坛食用也可随时加入周左右即可开坛食用也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用新鲜蔬菜，不断取用2 2、用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么、用水封闭坛口起什么作用？不封闭有什么结果？结果？水封闭坛口起着使坛内水封闭坛口起着使坛内与坛外空气隔绝的作用与坛外空气隔绝的作用，空，空气中气中2121是氧气，这是是氧气，这是最简易最简易的造成无氧环境的方的造成无氧环境的方法这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进法这样，坛内可利用蔬菜中天然存在的乳酸菌进行乳酸发酵如不封闭，则会有许多需氧菌生长，行乳酸发酵如不封闭，则会有许多需氧菌生长，蔬菜会腐烂蔬菜会腐烂 3 3、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这、为什么泡菜坛内有时会长一层白膜，这层白膜是怎么形成的？层白膜是怎么形成的？形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。
酵母菌是兼性厌形成白膜是由于产膜酵母的繁殖酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌的繁殖也很丰富，适合酵母菌的繁殖 4 4、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不、为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不吃存放时间过长、变质的蔬菜？吃存放时间过长、变质的蔬菜？有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸有些蔬菜，如小白菜和萝卜等含有丰富的硝酸盐当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、盐当这些蔬菜放置过久时发生变质（发黄、腐烂）或者煮熟后存放太久时，腐烂）或者煮熟后存放太久时，蔬菜中的硝酸蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康危害人体健康 资料：泡菜含较多亚硝酸盐具致癌作用危害身体健康，所以不宜多吃 亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，亚硝酸钠为白色至淡黄色粉末或颗粒状，味微咸，易溶于水特点作用用于食品加工业中的发色剂和防腐剂使血液中正常携氧的低铁血红蛋白氧化成高铁血红蛋白食入0.30.5克的亚硝酸盐即可引起中毒甚至死亡， 转化成亚硝胺是致癌物危害分布 腌制肉制品、泡菜及变质的蔬菜含量较高原料加工修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片状加调味料装坛加盐盐水冷却泡菜盐水发酵成品测亚硝酸盐含量制作泡菜实验操作过程实验操作过程二、亚硝酸盐含量的测定二、亚硝酸盐含量的测定1 1、测定亚硝酸盐含量的原理、测定亚硝酸盐含量的原理在盐酸在盐酸酸化条件酸化条件下，下，亚硝酸盐亚硝酸盐与对与对氨基苯磺酸氨基苯磺酸发发生重氮化反应后，再与生重氮化反应后，再与N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐萘基乙二胺盐酸盐结合生成结合生成玫瑰红玫瑰红溶液。
溶液将经过反应显色后的待测将经过反应显色后的待测样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸样品与标准液比色，即可计算出样品中的亚硝酸盐含量2 2、材料与器具、材料与器具泡菜、对氨基苯磺酸、泡菜、对氨基苯磺酸、 N-1N-1萘基乙萘基乙二胺盐酸盐、氯化钠、氢氧化钠、氢二胺盐酸盐、氯化钠、氢氧化钠、氢氧化铝、氯化镉、氯化钡、亚硝酸钠氧化铝、氯化镉、氯化钡、亚硝酸钠、蒸馏水、移液管、容量瓶、比色管、蒸馏水、移液管、容量瓶、比色管、榨汁机等、榨汁机等3 3、步骤、步骤（1 1）配置溶液）配置溶液 对氨基苯磺酸溶液：称取对氨基苯磺酸溶液：称取0.40.4克对氨基苯磺酸，克对氨基苯磺酸，溶解于溶解于100ml100ml体积分数为体积分数为2020的盐酸中，避光保的盐酸中，避光保存存(4mg/ml)(4mg/ml) N-1 N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取0.20.2克克N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐，溶解于萘基乙二胺盐酸盐，溶解于100ml100ml的水中，避光的水中，避光保存保存(2mg/ml)(2mg/ml) 亚硝酸钠溶液：称取亚硝酸钠溶液：称取0.100.10克于硅胶干燥器中干燥克于硅胶干燥器中干燥2424小时的亚硝酸钠，用水溶解至小时的亚硝酸钠，用水溶解至500ml500ml，再转移，再转移5 5 mlml溶液至溶液至200 ml200 ml容量瓶，定容至容量瓶，定容至200ml200ml(5ug/ml)(5ug/ml) （2） 配制标准液 用移液管吸取用移液管吸取0.20ml0.20ml、0.40ml0.40ml、0.60ml0.60ml、0.80ml0.80ml、1.00ml1.00ml、1.50ml1.50ml亚硝酸钠溶液，分亚硝酸钠溶液，分别置于别置于50ml50ml比色管中，再取比色管中，再取1 1支比色管作为空支比色管作为空白对照。
并分别加入白对照并分别加入2.0ml2.0ml对氨基苯磺酸溶液对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置，混匀，静置3 35 5分钟后，再分别加入分钟后，再分别加入1.0ml 1.0ml N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至萘基乙二胺盐酸盐溶液，加蒸馏水至50ml50ml，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的剃度变，混匀，观察亚硝酸钠溶液颜色的剃度变化提取剂：分别称取提取剂：分别称取5050克克氯化镉、氯化钡氯化镉、氯化钡，溶解于，溶解于1000ml1000ml蒸馏水中，用盐酸调节蒸馏水中，用盐酸调节pHpH至至1 1氢氧化铝乳液和铝乳液和2.5mol/l2.5mol/l的氢氧化钠溶液的氢氧化钠溶液3 3） 制备样品处理液制备样品处理液 将将3 3坛样品做好标记后，分别称取坛样品做好标记后，分别称取0.40.4千克泡菜千克泡菜，榨汁过滤得，榨汁过滤得200ml200ml汁液取其中汁液取其中100 ml100 ml至至500ml500ml容量瓶中，加容量瓶中，加200ml200ml蒸馏水、蒸馏水、 100ml100ml提提取剂取剂，混匀，再加入，混匀，再加入40ml40ml氢氧化钠溶液，用蒸氢氧化钠溶液，用蒸馏水定容至馏水定容至500ml500ml后，立即过滤。
将后，立即过滤将60ml60ml滤液滤液转移至转移至100ml100ml容量瓶中，加入氢氧化铝容量瓶中，加入氢氧化铝（吸附脱（吸附脱色）色）乳液，定容至乳液，定容至100ml100ml，过滤4 4）比色）比色 吸取吸取40ml40ml透明澄清的滤液，转移到透明澄清的滤液，转移到50ml50ml比色管比色管中，将比色管做好标记按步骤中，将比色管做好标记按步骤2 2的方法分别加入的方法分别加入对氨基苯磺酸溶液和对氨基苯磺酸溶液和N-1N-1萘基乙二胺盐酸盐溶液萘基乙二胺盐酸盐溶液，并定容至，并定容至50ml50ml，混匀，静置，混匀，静置1515minmin2001年1月4日（封坛前）2001年1月8日2001年1月12日2001年1月15日2001年1月19日0.150.600.200.100.101号坛2号坛0.150.200.100.050.053号坛0.150.800.600.200.20实验结果4 4、实验结果分析和讨论选录、实验结果分析和讨论选录三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数三只泡菜坛中的亚硝酸盐含量变化的绝对数量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同在量虽然不同，但整体的变化趋势却基本相同。
在腌制后的第五、七天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的腌制后的第五、七天，三只泡菜坛中亚硝酸盐的含量都达到最高峰（含量都达到最高峰（1 1、2 2、3 3号坛中的亚硝酸盐号坛中的亚硝酸盐分别达到分别达到 0.6mg/kg 0.6mg/kg、0.2mg/kg0.2mg/kg、0.8mg。