第二节 RNA的转录后加工,RNA成熟 转录后加工（post-transcriptional processing）,一 原核生物中RNA的加工：,（一）原核生物 rRNA前体加工：,,,pppA,6500nt,（二）原核生物 tRNA前体加工：,1. tRNA前体两侧切断(cutting)及修剪(trimming) ： 1）5’ tRNA成熟酶 ——RNase P RNase P 蛋白：20 kDa RNA（M1RNA）：ribozyme RNase P是识别RNA特定空间结构而非一级结构的核酸内切酶,2）tRNA 3’-端：切割 —— RNase F 成熟 —— RNase D,2. tRNA 3’-末端CCAOH 结构的形成： （1）自身含有-CCAOH结构， 经过修剪后暴露 （2）由tRNA核苷酰转移酶催 化形成-CCAOH ： tRNA + 2CTP+ATP tRNA -CCAOH +3PPi,3. tRNA分子中核苷酸修饰 和异构化： 例如：假尿嘧啶（）的 形成（U糖苷键移位， N1 C5）,切除tRNA前体两端多余的序列： 5’—端切除几到10个核苷酸b、末端添加：3’-端添加CCA序列。
c、修饰：形成稀有碱基如DH2 核酸内切酶的作用,核苷酰转移酶的作用,核酸外切酶的作用,异构化酶的作用,,,,（三）原核生物 mRNA前体加工：,细菌的mRNA大多数不需要加工，边转录边翻译少数如核糖体蛋白L10和L7/L12和RNA聚合酶的和’亚基 组成多顺反子转录产物，需要经RNase III切割后分别翻译,细菌mRNA的特点：,①多顺反子：一个mRNA可以翻译出不止一个蛋白产物 ②半衰期短： mRNA降解在转录开始后1min就开始了 mRNA平均半衰期为2min（脊椎动物3hr) ③ 5’端无帽子结构， 3’端只有较短的polyA结构 ④ 起始密码上游7~12bp处有一个SD序列（Shine-Dalgarno sequence)，与核糖体小亚基16S rRNA 3’端互补,二 真核生物 RNA的一般加工：,（一）真核生物 rRNA前体加工： 真核生物 rRNA前体合成、加工及核糖体装配都在核仁中进行受核仁小分子RNA（snoRNA）指导 真核生物 rRNA基因无内含子，有也不被转录二）真核生物 tRNA前体加工：,真核生物 tRNA基因也是成簇排列，由RNA聚合酶III转录 真核生物tRNA基因：约1300个 果蝇tRNA基因：约850个 大肠杆菌tRNA基因：约60个 5’- tRNA成熟酶类似于原核生物RNase P（但其中的RNA不是ribozyme），3’- 端需要多种酶。
真核生物tRNA自身不含有-CCAOH结构，全部由tRNA核苷酰转移酶催化合成 甲基化、假尿嘧啶化,,（三）真核生物 mRNA前体加工：,真核生物基因是断裂基因（interrupted gene） 1977年Roberts和Sharp提出， 1993年Nobel医学/生理学奖 真核生物mRNA为单顺反子，含有内含子 内含子（intron) ：在RNA拼接时被切除的序列，不表达 也称为间隔序列（intervening sequence, IVS) 外显子（exon)：成熟RNA中出现的序列部分 真核编码蛋白的mRNA内含子基因结构特征：GT-AG规律 即： mRNA内含子的 5’ –端都是GU；而3’ –端都是AG,核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA， hnRNA)：,核内加工过程中mRNA前体形成的分子量大小不一的中间物也称为D -RNA hnRNA半寿期多数很短，几分钟至几小时而细胞质中的mRNA寿命较长，1~10hr,2. 真核生物mRNA加工的一般步骤：,（1） 5’ 帽子的形成（capping）: 5’ 帽子：真核生物mRNA 5’ –末端特征结构，是在mRNA 5’ –末端反向接上的一个甲基化的鸟苷酸。
典型5’ 帽子结构：m7GpppNpN…（Cap 0） m7GpppNmpN…（Cap I） m7GpppNmpNmpN…（Cap II） m7G：G碱基7位甲基化；Nm：核糖2’-OH甲基化,5’ 帽子功能：稳定mRNA，不被5’ 核酸外切酶水解； 翻译起始的识别功能； 有助于mRNA转运,（2） 3’ 尾巴的形成（tailing）:,3’ 尾巴： 真核生物mRNA的3’–端大都有20 – 200个腺苷酸构成的polyA长链形成于核内加工时期 作用：稳定3’-端，mRNA 的polyA尾巴越长，可供降解的 时间越长，寿命越长 与核内向细胞质转移有关 不是所有真核生物蛋白mRNA都有polyA尾巴，如组蛋白,真核生物的mRNA在3’–端存在保守的加尾信号（AAUAAA） RNase III识别加尾信号，在其下游10~30 Nt处切断， mRNA脱落 由多聚腺苷酸聚合酶加上20~200Nt的polyA尾巴3’ 尾巴的形成:,（3） mRNA的内部甲基化： m6A，在hnRNA加工中起识别作用，不是翻译所必需4）内含子的切除及RNA拼接： 核内小分子RNA与拼接体,三 . RNA拼接：,真核RNA的内含子切除以及拼接等方式是多样化的 是基因表达调控的一个重要方面 1）类型I自我拼接 (group I self-splicing) 2）类型II自我拼接 (group II self-splicing) 3）核mRNA的拼接体的拼接 (nuclear mRNA spliceosomal) 4）核内tRNA前体的酶促拼接 (nuclear tRNA enzymatic) 5）反式拼接（trans- splicing ) 6）选择性拼接（alternative splicing ),1） 类型I自我拼接（group I self-splicing)：,1983年，Cech T 发现。
1989年获得Nobel化学奖 嗜热四膜虫26s rRNA前体（413Nt），在成熟过程中无需酶的催化，但需5’-GMP 和Mg2+ , 是由其IVS(内含子）自我催化完成的2） 类型II自我拼接（group II self-splicing),1982，Altman S1989年获得Nobel化学奖 II型内含子（RNAase P的M1RNA)在催化剪接反应时不需要鸟苷酸，但需要Mg2+,3) 核mRNA拼接体拼接 （nuclear mRNA splicesomal splicing),真核生物 hnRNA的拼接是由核内小分子RNA（snRNA）来承担 snRNA：100-300个Nt的RNA，U含量高的称为U系列 snRNA 其中除了U3以外，U1 – U6都参与 hnRNA的加工 拼接体（splicesome）：snRNA与蛋白构成核糖核蛋白 （snRNP），并组装成为50-60S的椭球体分支点,拼接体,,真核生物mRNA的拼接过程,拼接体识别、结合hnRNA内含子5’及3’区域 外显子靠近，形成套索RNA (lariat RNA) 两步转酯反应，切去内含子，连接外显子,4) 核内tRNA前体的酶促拼接 （nuclear tRNA enzymatic splicing ),催化酵母tRNA前体拼接的酶识别的不是内含子的序列，而是特定的二级结构,5） 反式拼接 ：,顺式拼接：分子内的拼接 反式拼接：生物体内存在的分子间的拼接方式。
较少见 例如：锥虫的多种mRNA,,,,6）选择性拼接（alternative splicing ) ：,选择性拼接（alternative splicing ) ： 在不同发育阶段或不同组织器官中，mRNA以不同的方式拼接 同源蛋白：经选择性拼接得到的不同蛋白产物 例如：降钙素 和 降钙素基因相关肽 polyA polyA 脑中 肾上腺 1-2-3-4（降钙素 ） 1-2-3-56（降钙素基因相关肽）,,,,,② 哺乳动物载脂蛋白B （Apo B）： 在肝脏正常合成Apo B 100而在小肠中，CU，导致终止密码UAA出现，肽链合成提前终止，合成Apo B 48RNA编辑：改变RNA编码序列的方式 RNA编辑类型：多种 ① U的插入与删除： 指导RNA (guide RNA, gRNA)为模板的转酯反应例如：锥虫线粒体mRNA插入4个U，校正了基因-1移码突变,四 RNA编辑（ RNA editing）与化学修饰：,,③ 脑Glu受体亚基mRNA： AI， 多个Gln Arg RNA编辑意义：修正有害基因突变； 增加基因产物多样性； 与组织发育与分化的有关的调控方式,五 RNA再编码（RNA recoding),RNA再编码： 对RNA编码序列阅读方式的改变 主要方式：利用校正tRNA。
（校正tRNA：是变异的tRNA，反密码子环碱基发生改变，或是决定tRNA特异性即个性的碱基发生改变，从而改变了译码规则，使错误的编码信息受到校正消除错义、无义和移码突变的影响 ① 改变反密码子或决定tRNA特异性的碱基 ② 阅读二联体或四联体密码子方式，修正移码突变,第三节 RNA指导下的 RNA和DNA的合成,一 RNA复制 (RNA replication)： 主要存在于RNA病毒中 以RNA为模板，合成互补RNA的过程 条件： RNA复制酶催化（ RDRP ，专一性极高） 需要RNA模板、4种核糖三核苷酸和Mg2+ 复制进行的方向5’ 3’1. 噬菌体Q RNA的复制：,噬菌体Q RNA： 4500Nt, 可编码3-4个蛋白基因有重叠外壳蛋白在转录时发生通读，则产生A1蛋白 噬菌体Q RNA本身(+链) 是mRNA，可以直接翻译 只有一个起始密码是开放的复制酶亚基合成后，利用宿主的成分装配复制酶2 噬菌体Q复制酶组成：,噬菌体Q复制酶专一性极高，只作用于自身RNA，对宿主RNA 及其它RNA无反应并且强烈抑制核糖体与RNA结合首先酶吸附在Q RNA3 ’端，以Q正链为模板合成负链；再以负链为模板合成大量正链，并合成成熟所需要的蛋白。
需要HFI和HFII 速度35Nt/s,不需HFI和HFII,Q噬菌体复制特点：,（1）尽可能利用宿主成分，简化自身基因组 （2）各种蛋白成分效率高，兼具多种功能： Q复制酶: 复制专一性极高；蛋白合成阻遏物 外壳蛋白：结构蛋白；复制酶合成的调节蛋白 （3）基因表达采用时序调控方式,3 病毒RNA复制的主要方式：,（1）含正链RNA的病毒：噬菌体Q、灰质炎病毒 先合成复制酶及相关蛋白 RNA复制 蛋白合成装配 （2）含负链RNA及复制酶的病毒：狂犬病病毒 利用自身携带的复制酶 合成正链RNA 合成病毒蛋白 （3）含双链及复制酶的病毒：呼肠孤病毒 以双链为模版 不对称转录出正链RNA 合成病毒蛋白 RNA复制 （4）致癌RNA病毒：一般含有两条相同正链RNA（二倍体） 先经过逆转录 合成DNA mRNA 蛋白,二 RNA 逆转录（reverse transcription）,逆（反）转录：以RNA为模板合成DNA 1 逆转录酶 (reverse transcriptase)： 依赖RNA的DNA聚合酶 (RNA-dependent DNA polymerase, RDDP)、 RNA指导的DNA 聚合酶 (RNA-directed DNA polymerase) 1970年Temin H.等发现逆转录酶 ， 证实前病毒学说。
1975年，获得诺贝尔医学/生理学奖,2 逆转录酶的性质：,需引物（tRNA)、模板和Mg2+等二价阳离子 按照5’3’合成 是多功能酶： （1）具有RNA指导的DNA。