激光扫描共聚焦显微镜吴 旭2009.10.20 高级显微镜原理 正置、倒置显微镜 细胞遗传工作站 活细胞工作站 激光显微分离系统 激光共聚焦显微镜概述 激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope，LSCM） 生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究 高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测光镜2um0.020.2um电镜0.1nm历史 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利 1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面 1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学 1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描 1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统 Confocal microscopy comes of age JG White & WB Amos. Nature 328, 183 - 184 (09 July 1987) Zeiss、Leica、Olympus、NikonZeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜Prairie Ultima IV 活体双光子显微镜国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜基本原理 相差、DIC 常用荧光标记 共聚焦原理Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in (A) reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them. A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B) undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope. D. Phase-contrast or a differential-interference-contrast microscopeFour types of light microscopy. (A) The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, a technique known as bright-field microscopy. The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B) phase-contrast microscopy, (C) Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D) dark-field microscopy. Visible lightdetectorSpecimenObjective1st Wollaston Prism起偏器DIC 检偏器2nd Wollaston PrismAnalyzerLight pathDifferential Interference Contrast (DIC) (Nomarski)微分干涉是利用特制的棱镜来分解光束。
分裂出来的光束的振动方向相互垂直且强度相等，光束分别在距离很近的两点上通过被检物体，在相位上略有差别由于两光束的裂距极小，而不出现重影现象，使图象呈现出立体的三维感觉常用荧光探针ProteinsNucleic AcidsDNAIonspH Sensitive IndicatorsOxidation StatesSpecific Organelles荧光显微镜原理 明场：透射 荧光：落射落射的优点： 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高 激发光损失小，荧光效应高共聚焦原理由于pinhole的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT探测器探测到，从而提高了成像效果通过对样品在x-y方向上的逐点扫描，可以形成二维图像如果调解焦平面在z方向的位置，连续扫描多个不同z位置的二维图像，则可以形成一个3D图像，3D的重建需要软件的支持The unique scanning module is thecore of the LSM 510 META. It contains motorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionable pinholes, and highly sensitive detectors including the META detector. All these components are arranged to ensure optimum specimen illumination and efficient collection of reflected or emitted light. A highly efficient optical grating provides an innovative way of separating the fluorescence emissions in the META detector. The grating projects the entire fluorescence spectrum onto the 32 channels of the META detector. Thus, the spectral signature is acquired for each pixel of the scanned image and subsequently can be used for the digital separation into component dyes.分光镜组件结构共聚焦构成光学显微镜激光光源扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜）光检测器计算机系统（数据采集、处理、转换应用）图形输出设备XYSequentially illuminated sampleSequentially generated imageLCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管 图像相关概念 RGB三基色 图像数据位亮度对比度饱和分辩率怎样得到样品图像 样品的标记物有合适的激发波长和发射波长 荧光下观察选择合适的图象 设置激光扫描的通道参数 设置图象的属性 调节每一个通道的亮度、对比度、清晰度、背景亮度 启动共聚焦和CCD照片的比较 更大的动态范围 高灵敏度 图像背景的消除 灵活的拍照区域选择 ZOOM功能 伪彩色 环境要求高多通道图象合成时间序列Ca离子成像 FRAP：Fluorescence Redistribution After Photo bleaching FRAP是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测,因而可得到活细胞的动力学参数。
LSCM可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域荧光漂白恢复（FRAP）人卵细胞的局部光漂白FRAP 研究ER-GFP的核转位荧光共振能量转移（FRET） FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer 能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体 能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移DonorAcceptor10 r 100 FRET产生条件： 两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2 供体与受体的距离在2-7nm 供体的发射波长与受体的激发波长一致应用实例一、组织光学切片 对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列光学切片这一功能又被简称为“细胞CT” 二、三维图像重建 由共聚焦显微镜的组织光学切片功能采集获得的二维图像数据，经计算机图像处理三维重建软件重组，可得到标本的三维立体结构，揭示亚细胞结构的空间关系，从而能十分灵活直观地进行形态学研究。
三、细胞物理和生物化学测定 激光扫描共聚焦显微镜可进行低光探测、活细胞定量分析和重复性极佳的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的溶酶体、线粒体、内质网、细胞骨架、结构性蛋白质、DNA、RNA、酶和受体分子等细胞结构的含量、组分及分布进行定性、定量及定位测定另外，激光扫描共聚焦显微镜可以对细胞的面积、细胞周长等参数进行自动测定四、荧光的定性、定量分析 激光扫描共聚焦显微镜可对单标记或多标记细胞及组织标本进行定量分析，并显示荧光沿Z轴的强度变化；另外，借助于光学切片功能可在毫不损失分辨力的条件下测量标本深度的荧光分布可以准确监测抗原表达、荧光原位杂交及细胞结合和杀伤的形态学特性并进行定量分析五、CA2+、pH及其它细胞内离子的动态测量 利用Fluo-3、Indo-1、Fura-Rad等多种荧光探针，激光扫描共聚焦显微镜可对单个细胞内离子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、pH等）的动态变化做实时定量分析；可以定量探测胞内Ca2+对肿瘤启动因子、化学因子、生长因子及各种激素等刺激的反应；使用双荧光探针Fluo-3和SNAF可同时测定Ca2+和pH值也就是说利用激光扫描共聚焦显微镜能进行细胞生理信号的动态监测。
共聚焦显微镜的局限标记染料的光漂白： 为了获得足够的信噪比必须提高激光的强度；而高强度的激光会使染料在连续扫描过程中迅速褪色光毒作用： 在激光照射下，许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素限制扫描时间、激发光强度，以保持样品的活性双光子激发原理1931年，Maria Goppert-Mayer预言一个分子或院子可以在同一个量子过程中，同时吸收两个光子而成为激发态。