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1、第六章 食品中真菌及其检验,霉菌与酵母计数 常见产毒霉菌的鉴定,霉菌的生物学特征,霉菌是丝状真菌的俗称，意即“发霉的真菌”，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。 霉菌有着极强的繁殖能力，而且繁殖方式也是多种多样的。虽然霉菌菌丝体上任一片段在适宜条件下都能发展成新个体，但在自然界中，霉菌主要依靠产生形形色色的无性或有性孢子进行繁殖。,图片,霉菌的菌落,由于霉菌的菌丝较粗而长，因而霉菌的菌落较大，有的霉菌的菌丝蔓延，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直径12厘米或更小。 菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，
2、不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状； 菌落与培养基的连接紧密，不易挑取； 菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。,Photo of mould conoly,真菌与食品腐败,由于它们生长缓慢和竞争能力不强，故常常在不适于细菌生长的食品中出现，这些食品是pH低、湿度低、含盐和含糖高的食品、低温贮藏的食品，含有抗菌素的食品等 。 由于霉菌和酵母能抵抗热、冷冻，以及抗菌素和辐照等贮藏及保藏技术，它们能转换某些不利于细菌的物质，而促进致病细菌的生长。 有些霉菌能够合成有毒代谢产物霉菌毒素。 霉菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。,酵母的生物学特征,酵母菌是单细胞真核微生物。 酵母菌细
3、胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等。 酵母菌无鞭毛，不能游动。 大多数酵母菌的菌落特征与细菌相似，但比细菌菌落大而厚，菌落表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一，菌落多为乳白色，少数为红色，个别为黑色。,霉菌和酵母可以作为评价食品卫生质量的指示菌，并以霉菌和酵母计数来制定食品被污染的程度。,霉菌和酵母计数 GB 4789.15-2010,本标准规定了食品中霉菌和酵母（moulds and yeasts）计数的检验方法。 本标准适用于各类食品中霉菌和酵母菌的计数。,霉菌和酵母的计数,定义：霉菌和酵母菌数的测定是指食品检样经过处
4、理，在一定条件下培养后，所得1克（毫升）检样中所含的霉菌和酵母菌落总数。（粮食样品是指1克粮食表面的霉菌总数。） 检测方法：平板倾注混合法。,真菌检测与细菌检测,培养基： 细菌是计数平板；真菌是PDA（加抗菌素）、孟加拉红培养基。 温度：细菌37，真菌2528 培养时间：细菌2天，霉菌3-5天 计算方法：细菌30300个/皿；霉菌10150个/皿 稀释度的选择与报告方式：一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告之 。菌落蔓延，报告为多不可计（细菌总数，则直接报告菌落蔓延）。,霉菌直接镜检计数法,本方法适用于各种加工的水果和蔬菜制品，如番茄酱、果酱和果汁等。 霉菌可以作
5、为一种指示菌，表明加工制品的原料有霉菌所致的腐烂存在。 此法系在一个标准计数玻片上计数含有霉菌菌丝的显微镜视野。,玻片,郝氏计测玻片或称霍华德（Howard）霉菌计数器。 是一特制的、具有标准计测室的玻片。系特制的玻璃载片，带有一个20mm15mm的长方形平面，即计测室，其周围有沟，两侧各有一条高出长方形平面0.1mm的肩堤，盖片放在肩堤上面，盖片和长方形平面之间相距0.1mm。中央长方形平面，肩堤和盖片共同形成一个光学工作面。为了便于校正显微镜，计测玻片上刻有两条相距1.382mm的平行线，作为校正显微镜视野的标准线 。,显微镜,霉菌直接计数用的双筒显微镜一定要有标准化视野，在90125倍时
6、视野直径为1.382mm。 同时在一个目镜中装配有一个特制的测微玻璃圆盘，其上刻有每边长度相当于视野直径1/6的36个小方格 。,霉菌直接镜检计数法,检样的制备：取定量检样，加蒸馏水稀释至折光指数为1.34471.3460(即浓度为7.9%8.8%)，备用。 显微镜标准视野的校正：将显微镜按放大率90125倍调节标准视野，使其直径为1.382mm。 涂片：洗净郝氏计测玻片，将制好的标准液，用玻璃棒均匀的摊布于计测室，以备观察。 观测：将制好之载玻片放于显微镜标准视野下进行霉菌观测，一般每一检样应观察50个视野，最好同一检样两人进行观察。,霉菌菌丝的特征,（1）平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况下
7、，整个菌丝体的直径是一致的。因此在显微镜下菌丝壁看起来像两条平行的线。这是区别霉菌菌丝和其他纤维时最有用的特征之一。 （2）横隔：许多霉菌的菌丝具有横隔，毛霉、根霉等少数霉菌的菌丝没有横隔。 （3）菌丝内呈粒状：薄壁、呈管状的菌丝含有原生质，在高倍显微镜下透过细胞壁可见其呈粒状或点状。 （4）分枝：如菌丝不太短，则多数呈分枝状，分枝与主干的直径几乎相同，有分枝是鉴定霉菌最可靠的特征之一。 （5）菌丝的顶端：常呈钝圆形。 （6）无折射现象。 凡有以上特征之一的丝状体均可判定为霉菌菌丝。,霉菌直接镜检计数法之计算,观察视野中有无菌丝，凡符合下列情况之一者为阳性视野 ： （1）一根菌丝长度超过视野直
8、径1/6； （2）一根菌丝长度加上分枝的长度超过视野直径1/6； （3）两根菌丝总长度超过视野直径1/6； （4）三根菌丝总长度超过视野直径1/6； （5）一丛菌丝可视为一个菌丝，所有菌丝（包括分枝）总长度超过视野直径1/6； 根据对所有视野的观察结果，计算阳性视野所占比例，并以阳性视野百分数（%）报告结果。,检查视野数的确定,对一般样品，每个涂片均检查50个视野（每一个样品至少应测25个视野，才能代表样品的各个部分。 如果检查结果阳性视野低于30，则检查25个视野即可；如果在3040之间，须检查50个视野；如果在4050之间，须检查100个视野；如果在50以上或超过更多，则要继续检查，直至检
9、查25个视野的结果与一系列计算结果无差异为止）。 所检查的50个视野要均匀地分布在计测室上，可用显微镜载物台上带有标尺的推进器来控制，从上到下，或从左到右一行行有规律地进行观察。 无法判断视野中丝状物是否菌丝，可以放大观察倍数。,各国番茄酱罐头霉菌直接镜检计数标准,常见产毒霉菌的鉴定,【GB 4789.162003】 本标准规定了食品中常见的产毒霉菌的鉴定方法 。 本标准适用于曲霉属、青霉属、镰刀菌属及其他菌属的产毒菌种的鉴定。 鉴定步骤：菌落观察斜面观察制片镜检报告,真菌的毒素（霉菌）,分类（按作用的组织）：肝毒素、肾毒素、神经毒素、心脏毒素、造血器官毒素等。不同的菌有不同的毒素，同一种菌会
10、产不同的毒素。 危害 急性中毒：一次吃大量毒素引起。发生于人较少，动物较多。 慢性中毒：长期、少量摄入引起，类似维生素缺乏症，一般疗效差。 易被污染的食品：巴氏消毒的食品、粮食、调味品、发酵食品。,霉菌毒素的作用,减少细胞分裂 抑制蛋白质合成和DNA复制 抑制DNA和组蛋白形成复合物 影响核酸合成 降低免疫应答,霉菌产毒特点,霉菌产毒仅限于少数的产毒霉菌，而且产毒菌种中也是一部分菌株产毒； 产毒菌株的产毒能力表现出可变性和易变性； 一种菌株或菌种可以产生几种不同毒素，多种霉菌可能产生同一毒素； 产毒菌株产毒需要一定条件。,菌落的观察,为了培养完整的巨大菌落以供观察记录，可将纯培养物点植于平板上
11、。 方法是：将平板倒转，向上接种一点或三点，每菌接种两个平板，倒置于2528温箱中进行培养。 当刚长出小菌落时，取出一个平皿，以无菌操作，用小刀将菌落连同培养基切下1cm2cm的小块，置菌落一侧，继续培养，于514d进行观察。此法代替小培养法，可直接观察子实体着生状态。,斜面观察,将霉菌纯培养物划线接种(曲霉、青霉)或点种(链刀菌或其他菌)于斜面，培养514d； 观察菌落形态，同时还可以将菌种管置显微镜下用低倍镜直接观察孢子的形态和排列。,制片,取载玻片加乳酸苯酚液一滴，用接种针钩取一小块霉菌培养物，置乳酸苯酚液中，用两支分离针将培养物撕开成小块，切忌涂抹，以免破坏霉菌结构。 然后加盖玻片，如
12、有气泡，可在酒精灯上加热排除。 制片时最好是在接种罩内操作，以防孢子飞扬。,镜检与报告,观察霉菌的菌丝和孢子的形态和特征、大小、颜色、孢子的排列等，并做详细记录。 根据菌落形态及镜检结果，参照以下各种霉菌的形态描述及检索表，确定菌种名称。,主要污染的食品,曲霉属(Aspergillus),本属的产毒霉菌主要包括黄曲霉、寄生曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉和棕曲霉。这些霉菌的代谢产物为黄曲霉毒素、杂色曲霉素和棕曲霉毒素。 曲霉属的颜色多样，而且比较稳定。营养菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，无色或有明亮的颜色。 分生孢子梗大都无横隔，光滑、粗糙或有麻点。菊花状分生孢子头。分生孢子头有各种不同颜色和形状，如球
13、形、放射形、棍棒形或直柱形等。曲霉属只少数种形成有性阶段，产生封闭式的闭囊壳。某些种产生菌核或菌核结构。少数种可产生不同形状的壳细胞。,曲霉,顶囊 小梗（单层或双层） 梗基 分生孢子 足细胞,黄曲霉(A.flavuss),属于黄曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长较快，1014d直径34或47cm，最初带黄色，然后变为黄绿色，老后颜色变暗，平坦或有放射状沟纹，反面无色或带褐色。 黄曲霉产生黄曲霉毒素，该毒素能引起动物急性中毒死亡，如长期食用含微量黄曲霉毒素的食物，能引起肝癌。,黄曲霉毒素,产毒条件：温度范围1242，最适产毒温度为33，最适Aw为0.930.98。 毒素种类：B1，B2 中毒症状
14、：肝毒素，抑制肝脏细胞中RNA的合成等 1、急性和亚急性中毒：肝细胞迅速变性、坏死，出血及胆管增生，在几天或十几天死亡。 2、慢性中毒：肝功能降低、硬化，在几周或十几周死亡。 3、致癌性：小剂量反复或一次性大剂量摄入，引起肝癌。,寄生曲霉(A.parasiticus),属于黄曲霉群，810d菌落2.54cm，平坦或带放射状沟纹，幼时带黄色，老后呈暗绿色，反面，奶油色至淡褐色。 寄生曲霉的菌株都能产生黄曲霉毒素。,黄曲霉,杂色曲霉(A.versicolor),属于杂色曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长局限，14d直径23cm，绒状、絮状或两者同时存在。颜色变化相当广泛，不同菌系可能局部淡绿、灰绿
15、、浅黄甚至粉红色；反面近于无色至黄橙色或玫瑰色。有的菌落有无色至紫红色的液滴。 有些菌系产生球形的壳细胞。 杂色曲霉产生杂色曲霉素，该毒素引起肝和肾的损害，并能引起肝癌。,构巢曲霉(A.nidulans),属于构巢曲霉群。菌落生长较快，14d直径56cm，绒状，绿色，有的菌系由于产生较多的闭囊壳而显现黄褐色，反面紫红色。 闭囊壳球形，暗紫红色，直径135150m。子囊孢子双凸镜形，紫红色，约5m4m，有两个鸡冠状突起。闭囊壳外面包围着一层壳细胞，淡黄色，球形，壁厚，直径约25m。 构巢曲霉产生杂色曲霉素。,赭曲霉(A.ochraceus),属于赭曲霉群。在察氏琼脂培养基上菌落生长稍局限，101
16、4d直径34cm，褐色或浅黄色，基质中菌丝无色或具有不同程度的黄色或紫色，反面带黄褐色或绿褐色。 有些菌系产生较多的菌核，初期为白色，老后淡紫色，球形、卵形至柱形，直径达1mm。 赭曲霉产生赭曲霉毒素，该毒素是种强的肾脏毒和肝脏毒,赭曲霉毒素,赭曲霉毒素包括A、B、C等7种结构类似的化合物，其中以赭曲霉毒素A毒性最大。由赭色曲霉属和几种青霉属产生。 赭曲霉毒素可损害动物肾脏和肝脏，有致畸和致癌作用。 一般容易感染赭曲霉毒素A的商品包括的大豆、绿豆、绿咖啡豆、啤酒、调味品、草本植物等。,青霉属(Penicillium),本属产毒霉菌，主要包括黄绿青霉、桔青霉、圆弧青霉、展开青霉、纯绿青霉、红青霉、产紫青霉、冰岛青霉和皱褶青霉等。 青霉属的营养菌丝体呈无色、淡色或鲜明的颜色，具横隔。气生菌丝密毡状、松絮状或部分结成菌丝索。 分生孢子梗由埋伏型或气生型菌丝生出，稍垂直于该菌丝，具横隔，光滑或粗糙。其先端生有扫帚状的分枝轮，称为帚状枝。孢子多数呈蓝绿色，有时呈无色或呈别种淡色
