Chapter 5 聚合酶链式反应体外扩增DNA,,美国Mullis教授 开汽车时的联想,Chapter 5 聚合酶链式反应体外扩增DNA,聚合酶链式反应示意图,PCR仪,PCR反应体系示意图,Chapter 5 聚合酶链式反应体外扩增DNA,,Chapter 5 聚合酶链式反应体外扩增DNA,聚合酶链式反应 制备克隆用PCR产物的纯化 克隆化的PCR产物连入T载体 通过PCR扩增在扩增DNA产物末端引入酶切位点 应用mRNA反转录扩增cDNA（RT-PCR） 克隆在原核载体的DNA片段的快速鉴定 长距离PCR 反向PCR 实时荧光定量PCR,1. 聚合酶链式反应,PCR反应的基本成分： 一种热稳定DNA聚合酶 一对引导DNA合成的寡核苷酸引物 脱氧核苷三磷酸 二价阳离子，通常是Mg2+ 维持pH值的缓冲液 一价阳离子（缓冲液中含50mmol/L KCl） 模板DNA,（1）DNA聚合酶,1. 大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段，不耐热，每次循环需重加酶 2. Taq酶（1988年）：是从温泉耐高温细菌中提取的耐热性DNA聚合酶，其活性需要Mg2+ 但Taq-DNA聚合酶有一定错配率（无3’→5’外切酶活性，有5’→3’外切酶活性），为0.1%-0.25%（30次cycle）；若要细胞克隆PCR扩增的产物，进行表达，扩增后必须测序证实才可使用。
3. Tth、Pfu、Vent聚合酶：具有校读功能2）寡核苷酸引物,1. 长度：16-30bp ，一对引物 过短—非特异性扩增增加，竟争并抑制特异扩增， 从而降低扩增的灵敏性； 过长—易形成稳定的杂合体或链内互补，使引物的延伸温度超过Taq酶的最适温度，同时还使检测成本增加 2. G+C含量：占40-60%，Tm值在55 ℃以上 3. 碱基的随机分布：不要有连续3个以上的相同嘌呤或嘧啶存在2）寡核苷酸引物,4. 引物自身不存在互补碱基（连续互补至少小于3bp)，防止二聚体的形成 5. 一对引物间不应互补（连续互补至少小于4bp），尤其是它们的3’端不应互补 6. 引物的纯度要高 7. 引物与非特异靶区之间的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，否则导致非特异性扩增2）寡核苷酸引物,8. 引物的3’端一定要与模板配对（引物的特异性，引发延伸的点），以引物3’端A影响最大；末端最佳选择为G 和C；引物3’端也不要是编码密码子的第三个碱基，以免因为密码子第三位的简并性而影响扩增特异性 9. 引物的5’端可以修饰：包括加酶切位点，用生物素、荧光物质、地高辛等标记，引入酶切位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。
10. 引物的设计最好以电脑软件进行指导3） 脱氧核苷三磷酸,四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸： 即dATP、dTTP、dCTP、dGTP 一般浓度在200-250μmol/L 高浓度dNTP对扩增反应起抑制作用，可能因为dNTP与Mg2+螯合引起的效应 若扩增片段在约1kb，每种dNTP浓度控制在20 μmol/L至0.5-1.0 pmol/L，效果较好4）二价阳离子,热稳定的DNA聚合酶要求有二价阳离子激活，通常是Mg2+ 由于dNTP与寡核苷酸结合Mg2+ ，阳离子的摩尔浓度必须超过dNTP与引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度 一般在0.5-5.0 mmol/L5）维持pH值的缓冲液,一般用Tris-Cl在室温将PCR缓冲液的pH调至8.3-8.8之间，标准PCR缓冲液中Tris-Cl浓度在10 mmol/L 在72℃温育时（即PCR延伸阶段的温度），反应体系的pH值会下降一个单位，导致缓冲液的pH接近7.26）一价阳离子,标准PCR缓冲液中含50 mmol/L KCl，它对于扩增大于500 bp长度的DNA片段是有益的 提高KCl 浓度到70-100 mmol/L范围内，对改善扩增较短的DNA片段产物是有利的。
7）模板DNA,可以单链或双链形式加入到PCR反应液中 闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA分子 尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但是使用高分子量的DNA（10kb以上）作模板时，如果用限制性内切酶先消化，则扩增效果更好聚合酶链式反应的设计,包括三个步骤，即变性、退火、延伸 1. 变性：一般在94-95℃ 30s，根据G+C含量 2. 退火（复性）：温度太高，难以复性，扩增效率降低；温度过低，非特异性复性，扩增出非特异性片段通常比理论计算的引物和模板的熔接温度降低3-5℃，一般30s 计算公式： Tm=2（A+T）+4（G+C） Tm=81.5+16.6(lg[K+])+0.41(%[G+C])-(675/n),3. 延伸：与DNA聚合酶的活性有关一般Taq DNA聚合酶的最适温度为72-78℃，延伸时间由扩增产物的长度决定，一般1kb用1分钟来保证充足的时间 4. 循环数：由反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素一般30-35个循环聚合酶链式反应的设计,循环数主要取决于最初靶分子的浓度。
如： 3x105、 1.5x104、 1x103 25~30、 30~35、 35~40 过多的循环次数会增加非特异性产物量及碱基错配数； 平台效应：PCR反应后期，扩增产物并不成指数方式的增加； 产生原因：dNTP与引物浓度降低，酶对模板的比例相对降低，酶活力降低，产物浓度增高后变性不完全而影响引物延伸聚合酶链式反应的设计,1. 按以下次序，在0.5ml无菌离心管加入： 10×PCR缓冲液 5μl 20mmol/L 4种dNTP混合液 1μl 20μmol/L 正向引物 2.5 μl 20μmol/L 反向引物 2.5 μl 1-5U/ μl 热稳定DNA聚合酶 1-2单位 模板 5-10μl 用ddH2O 补足到50 μl,PCR反应具体操作方法,2. 设置反应、循环条件 预变性：94℃ 3-5min 变性 30-40 cycles 退火 延伸 延伸 72 ℃ 10min 保存 4 ℃,PCR反应具体操作方法,,3. 结果检测 吸取5μl反应后的溶液，用琼脂糖凝胶电泳来检测扩增结果，用DNA marker来判断扩增片段的大小。
扩增条带与预期大小要一致 可以用DNA序列分析，Southern杂交等方法鉴定PCR反应具体操作方法,PCR结果疑难问题分析,1. 目的条带呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到比期望分子量更小的DNA分子量的区域内 原因：无效引导或无效延伸 对策：（1）建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，找出两个引物的最适浓度和最佳镁离子浓度 （2）应用尽可能的退火温度 （3）考虑添加佐剂，如牛白蛋白（0.2-0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%）PCR结果疑难问题分析,2. 目的产物条带在阳性对照2（不含旁观者DNA和模板DNA）与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照1（含旁观者DNA，不含模板DNA）中有很强的条带 原因：模板DNA不纯 对策：重新纯化模板DNA，用酚氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收，纯化后的DNA样品溶解于水中（不含EDTA）PCR结果疑难问题分析,3. 在阴性对照中扩增出目的条带 原因：盛模板DNA的器具或溶解模板DNA的溶液污染所致 对策：（1）重新清洁所用器具 （2）重新提取模板DNA，溶解模板DNA的溶液不能有污染 （3）重做整个PCR试验PCR结果疑难问题分析,4. 扩增产物呈明显的分子质量错误的条带。
原因：根据一条或两条引物的非特异性引导 对策：（1）缩短复性时间或增加复性温度 5. 扩增目的产物DNA呈现模糊的广泛的成片条带 原因：引物二聚体所致或模板DNA过量 对策：检查引物是否均一、模板DNA序列内是否存在高度重复序列，优化每条独立引物的浓度 应用降落PCR或热启动PCR降低模板的量PCR结果疑难问题分析,PCR结果疑难问题分析,PCR结果疑难问题分析,2. 制备克隆用PCR产物的纯化,问题：PCR扩增片段经酶切后不能顺利地克隆到由相同酶切的载体上 原因： PCR产物经酚氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法纯化后，DNA样品中还残留一些具有酶活性的TaqDNA聚合酶或其它热稳定的DNA聚合酶以及一些dNTP DNA聚合酶会填平由限制酶消解产生的3’凹端制备克隆用PCR产物的纯化方法,1. 集中8支PCR反应管的反应液约400μl，内含目的基因扩增片段1μg 2. 加0.2倍体积的5×蛋白酶K缓冲液和终浓度至50μg/ml的蛋白酶K温育反应混合液在37℃水浴60min 3. 用75℃水浴20min加热灭活蛋白酶K 4. 反应混合液用酚氯仿与氯仿各抽提一次 5. 用乙醇沉淀法回收DNA扩增产物。
制备克隆用PCR产物的纯化方法,6. 用微量离心机于4℃高速离心5min，回收沉淀下来的DNA，小心弃去上清，用1ml 70%乙醇于室温洗涤沉淀的样品，再次离心样品，弃去上清，使乙醇挥发殆尽 7. 将沉淀下来的DNA样品溶于TE，一般推测扩增DNA样品的回收率在50%-80% 8. 可取纯化后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，计算DNA样品的实际含量3. 克隆化的PCR产物连入T载体,T载体有与A碱基互补的未配对3’T碱基 T载体可用以下三种方法构建： 1. 可用限制性内切核酸酶如XcmI、HphI与MboII酶切产生3’末端未配对T碱基 2. 应用末端转移酶与双脱氧TTP加入一个突出的T残基到线性化载体的3’末端 3. 应用不依赖于模板的Taq DNA聚合酶的末端转移酶活性性化载体的3’末端处的羟基基团上催化连接上一个T碱基克隆化的PCR产物连入T载体的方法,1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液 PCR扩增的目的DNA 3 μl T载体 0.5μl 10 ×连接缓冲液 1 μl 噬菌体T4DNA连接酶 1 μl 用H2O补足至 10 μl 2. 将连接混合液在14℃温育4h。
3. 取连接反应后的混合液适量，转化大肠杆菌感受态细胞克隆化的PCR产物连入T载体的方法,4. 将转化的细胞涂布在含有抗生素、IPTG和X-gal的固体培养平板上 5. 过夜培养后，挑取白色菌落，进行培养 6. 提取质粒DNA 7. 用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定，或用PCR进行鉴定 8. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆DNA片段的大小 9. 通过测序来分析PCR扩增片段的正确性4. 通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点,用于PCR扩增的寡核苷酸引物的5’末端常被设计加入相应的内切酶酶切位点 扩增产生的目的片段的双末端被引入新的酶切位点经酶切消化后的扩增片段能定向克隆至相应的载体 用相应的内切酶消化纯化后的扩增片段与载体连接，将连接液转化大肠杆菌，即可完成克隆通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点,,通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点,1. 设计带有限制性酶切位点的正向和反向引物，进行PCR扩增 2. 电泳检查PCR扩增结果如果PCR产物电泳检查有多条带，可通过低熔点琼脂糖纯化目的条带，纯化产物溶于TE 3. 取约100ng 纯化后的PCR产物，在20μl酶切体系中加入适量限制性内切核酸酶进行酶切消化。
通过PCR扩增在扩增DNA末端引入限制性内切酶酶切位点,4. 消化结束后，用酚氯仿和氯仿各抽提一次 5. 转移反。