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1、第十三章 生物制品分析概论,基本要求 概述 质量检验的基本程序与方法 常用定量分析方法及其应用 练习与思考,返回主目录,基本要求,1掌握本类药物质量检验的基本程序与方法类型。 2掌握HPLC法和酶活力测定法在本类药物测定中的应用。 3熟悉本类药物的范围、种类、质量控制的要点。 4了解本类药物含量测定的其他方法。,返 回,一、防病、治病的三大药源化学药物、生物药物、中药,第一节 概 述,Biopharmaceutics or Biopharmaceuticals,二、生物药物的定义 利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合利用生物学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的药物
2、。 广义的生物药物：天然活性生物物质、人工合成或半合成的天然物质类似物。,三、生物药物的发展 第一代：利用生物材料加工制成的含有某些天然活性成分物质与混合成分的粗提物制剂； 垂体后叶粉及其注射液 甲状腺粉及其片剂 胰酶及其肠溶片、肠溶胶囊,三、生物药物的发展 第二代：根据生物化学和免疫学原理，应用近代生化分离纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分； 尿激酶、肝素钠、胰岛素 人血白蛋白、人免疫球蛋白,三、生物药物的发展 第三代：应用生物工程技术生产的天然生理活性物质，以及通过蛋白质工程原理设计制造的具有比天然物质更高活性的类似物，或与天然物质结构不同的全新的药理活性成分。 重组人
3、生长激素、重组人IL-2,四、生物药物的分类 生化药物 生物合成药物 生物制品,1生化药物： 例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。,甘氨酸、丙氨酸,五肽胃泌素,硫酸鱼精蛋白,门冬酰胺酶、辅酶Q10,2.生物合成药物,由微生物代谢所生成的药物 利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物 山梨醇 木糖醇 甘露醇 枸橼酸 抗生素,3.生物制品,以微生物、细胞、动物或人源组织和体液等为原料，应用传统技术或现代生物技术制成。 疫苗 抗病毒及抗血清 血液制品 重组DNA制品 诊断制品等,疫苗类药物,用病毒或立克次体接种于动物、鸡胚，或经组织培养后加以处理制造而成。 细菌类疫苗 病毒类疫苗 联合疫苗 双价疫苗
4、及多价疫苗,抗病毒及抗血清类药物,抗病毒：用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动物所取得的免疫血清 抗菌（抗病毒）血清：用细菌或毒素本身免疫马或其他大动物所取得的免疫血清 抗体 被动免疫制剂,血液制品,由健康人的血液或经特异免疫的人血浆，经分离、提纯或由重组DNA技术制成的血浆蛋白组分，以及血液细胞有形成分。 主要用于临床治疗和被动免疫预防 人血白蛋白、人免疫球蛋白等,重组DNA制品,重组DNA制品,细胞因子类 生长因子类 激素类 酶类 疫苗 单克隆抗体,诊断制品,用于检测相应的抗原、抗体或机体免疫状态的制品。 毒素、诊断血清、分群血清、分型血清、因子血清、诊断菌液、抗原或抗体致敏血球、免疫扩散板
5、等 体外诊断制品和体内诊断制品,五、中国生物制品的发展历史 我国第一所生物制品生产、研究机构：中央防疫所（1919年）（北京生物制品研究所前身） 50年代，先后成立了北京、武汉、长春、成都、兰州、上海6大卫生部直属的生物制品研究所以及中国医学科学院昆明医学生物研究所、成都输血研究所。 一些常用的预防性制品和血液制品,五、中国生物制品的发展历史 60年代初成立中国药品生物制品检定所 80年代后，进入高速发展期：出现大量生物制品企业；种类、剂型快速增加；由预防性制品发展至诊断性制品，治疗、保健性制品,五、中国生物制品的发展历史 1956年成立卫生部生物制品委员会 1988年成立卫生部生物制品标准化
6、委员会。 在审批方面，为与化学药、中药区别，国家药品监督管理局专门制定了新生物制品审批办法,六、生物药物的特点 1、生物体的基本生化成分 2、分子量大、不确定：分子量测定 3、结构难确证 4、需检查生物活性 5、要求安全性检查 6、需做效价测定 7、全过程的质量控制,生物制品的全程控制,危险因素：异源物质、不稳定、易受微生物污染 全程质量控制：原材料、生产过程、最终产品 生物制品的生产特点： （1）来源于生物体 （2）制造过程涉及生物材料和生物学特征 （3）工艺存在易变性和安全性问题,生物制品的全程控制,全程质量控制尚无成熟的经验与方法 鉴定方法的独特性 生物制品安全性、有效性的保证： （1）
7、严格遵守GMP标准 （2）完善的制造检定规程 （3）各生产工序相适应的检定方法、标准操作细则（SOP） 药品国家标准：法定技术依据、标准,生物制品的国家标准,生物制品及鉴定规程草案（1952） 生物制品制造检定规程（1959） 中国生物制品规程（第6版 2000） 中华人民共和国药典（三部）（2005），收载101种生物制品,各部药典收载情况,一部药典：药材及饮片、植物油脂和提取物、成方制剂和单味制剂等； 二部药典：化学药品、抗生素、生化药品、放射性药品以及药用辅料等； 三部药典：生物制品，包括疫苗、抗毒素及抗血清、重组DNA制品、体内诊断制品等；,项目：1. 品名（中文通用名称、英文名称、汉
8、语拼音）2. 定义、组成及用途3. 基本要求4. 制造5. 检定（原液、半成品、成品）6. 保存运输及有效期7. 使用说明（仅预防类含此项）,生物制品质量控制的重点,有效成分的统一性、结构确证 有效成分的均一性、纯度检验 有害物质及残余杂质的控制 高效、灵敏的生物活性及比活性实验方法,生化药物和基因工程药物质量检验的基本程序与方法,鉴别试验,杂质检查,安全性检查,含量、效价测定,鉴别试验,理化鉴别试验化学反应法光谱鉴别法UV色谱鉴别法HPLC生物化学鉴别法酶法电泳法-等电聚焦电泳、PAGE 生物鉴别法,对比吸收光谱和特征吸收的一致性,对比色谱保留行为的一致性,第二节 鉴别试验,（一）理化鉴别法
9、1.化学鉴别法：例：胰蛋白酶+对甲苯基磺酰-L-精氨酸甲酯盐酸盐 紫色,2.紫外分光光度法 蛋白质的UV：芳香族氨基酸侧链（主要是酪氨酸、色氨酸，其次是苯丙氨酸） 重组人干扰素1b、2a、2b最大吸收峰278nm3nm； 重组人促红素：最大吸收279nm2nm；最小吸收250nm2nm；在320nm360nm处无吸收峰,3.高效液相色谱法 主峰保留时间和肽图的一致性 结合N-末端氨基酸序列分析，是蛋白质类生物制品精确的鉴别方法,高效液相色谱法： 1、反相高效液相色谱法 2、分子排阻色谱法 毛细管电泳 1、毛细管区带电泳CZE,重组人粒细胞集落刺激因子的肽图分析,1、RP-HPLC条件：Vyda
10、c C18 (150 4.6, 5m) MP:0.1%CF3COOH-CH3CN in gradient elution FR: 0.5 ml/min DW: 214 nm,2、CZE条件： 毛细管柱37cm75m，有效长度30 cm Buffer: 0.05 mol/L的磷酸盐水溶液，pH5.8 运行电压：12 KV DW： 214 nm,二、生化鉴别法 1.酶法：例：尿激酶的鉴别-气泡上升法原理：,激活,方法：取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置370.5恒温水浴保温，记时。反应系统在3040秒内凝结，凝结块内有气
11、泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法操作，凝结块在2小时内不溶。,2. 电泳法：以肝素鉴别为例。,与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。,三. 生物法：利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%葡萄糖注射液，惊厥停止。,第三节 杂质检查,一、特殊杂质检查,特殊杂质,生物污染物 产品相关杂质 工艺添加剂,生物污染物 1、微生物 2、细胞成分 3、培养基成分 4、有关大分子物质,宿主细胞、外源性DNA,牛血清白蛋白,重组制品中的鼠IgG,产品相关杂质 1、二聚体
12、和多聚体 2、脱氨或氧化产物 3、突变物 4、错误裂解产物 5、二硫化物异构体,工艺添加剂 1、残余抗生素 2、蛋白分离剂（聚乙二醇、乙醇） 3、佐剂氢氧化铝 4、产品稳定剂（辛酸钠、肝素） 5、防腐剂（苯酚、间甲酚等） 6、细菌与病毒灭活剂（甲醛等）,特殊杂质检查,1、宿主细胞蛋白残留量的检查 目的：控制异源蛋白的含量以防超量后引起机体免疫反应 测定法：酶联免疫吸附剂测定法ELISA 2、外源性DNA残留量的检查 目的：防止外源性DNA对人类的危害 测定法：分子杂交技术、基于DNA结合蛋白分析系统、实时定量PCR技术,3、产品相关杂质的检查同系物、异构体、降解产物等 测定法：HPLC和CE
13、4、残余抗生素的检查 目的：控制生物制品制备时抗生素的用量 测定法：抑菌试验,安全性检查,常规热原和细菌内毒素的检查 异常毒性试验 过敏试验 降压物质试验 无菌试验 一些特殊污染物的检查 致突变试验 生殖毒性试验,二、安全性检查,异常毒性试验：是用一定剂量的药物按照指定的操作方法和途径给予规定体重的某试验动物，观察其极性毒性反应。 小鼠、LD50,过敏试验：是对生化药物和基因工程药物中的异性蛋白进行进检查。 豚鼠、皮肤过敏和腹腔注射,降压物质检查：检查药物中能够导致血压降低的物质，如组胺类。猫或狗,无菌检查：对于不能进行高温灭菌的生物药品，必须进行无菌检查。,一些特殊污染物的检查：主要考虑外源
14、性DNA、一些杂蛋白等。,致突变试验：回复突变试验、染色体畸变试验等,生殖毒性试验,含量测定,HPLC SDS-PAGE,UV or Fluorescence,效价测定,第四节 含量（效价）测定,常用的定量分析方法及应用,理化分析法 生化分析法 生物检定法,理化分析法,化学分析方法 电化学分析法 光谱分析法 色谱分析法,重量法 容量分析法,重量法：根据样品中分离出来的单体或化合物的重量测定所含成分的含量的方法。,提取法：用适宜的溶剂提取样品中的某成分后挥去溶剂进行测定的方法。 挥发法：利用被测组分的挥发性，或经过衍生化后将其转化成挥发性物质来进行测定的方法。 沉淀法：将被测组分转化成沉淀，称定
15、沉淀的重量来计算含量的方法。,容量法：,胰酶中胰淀粉酶的测定：氧化还原滴定。淀粉溶液（底物）+胰淀粉酶还原糖，碘量法测定还原糖。 胰酶中胰脂肪酶的测定：酸碱滴定法。橄榄油乳液（底物） +胰脂肪酶脂肪酸，氢氧化钠滴定。,药物膜电极 生物组织膜电极 药物电极 微生物电极 离子选择性电极法 免疫电极 免疫场效应管 酶电极,电化学分析法,比色法,利用样品与显色剂发生现色反应，根据反应产物的颜色强度来测定含量。Elson-Morgan,硫酸软骨素的比色法测定：在酸性条件下使样品水解成氨基己糖，再在碱性条件下与乙酰丙酮和二甲氨基苯甲醛反应生成红色的产物，该产物在525 nm处有最大吸收。,光谱分析方法,具
16、体试验操作： 1、制备对照品溶液氨基葡萄糖 2、制备供试品溶液硫酸软骨素 3、反应和测定缩合反应和比色测定,A平为供试品溶液的吸收度 As平为对照品溶液的吸收度 Ws为对照品溶液的浓度（mg/ml） W为称样量（mg） 0.8309为校正因子 500为稀释倍数,以氨基葡萄糖计24.0,色谱法 1）RP-HPLC：反相高效液相色谱法 色谱柱柱：C8，18烷基硅烷键合相； 流动相：甲醇（或乙腈）水（或缓冲液）梯度洗脱 检测器：紫外、荧光检测器；电化学检测器应用：肽类、氨基酸、蛋白质、多糖的定量分析,2）HPIEC：高效离子交换色谱（high performance ion exchange chromatography ）应用：蛋白质，多肽的分离测定色谱柱：离子交换键合相流动相：0.3mol/L1.0mol/L的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度逐渐增大。尽量避免使用卤素类盐特点：可回收活性蛋白。,
