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1、实验一蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝法)实验目的v植物体内的可溶性蛋白质大多数是参与各种 代谢的酶类，测其含量是了解植物体总代谢 的一个重要指标。在研究每一种酶的作用时 ，常以比活（酶活力单位mg蛋白）表示 酶活力大小及酶制剂纯度。因此，测定植物 体内可溶性蛋白质是研究酶活的一个重要项 目。一、原理 v考马斯亮蓝G-250（Coomassit brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的 一种。在一定蛋白质浓度范围内（5 100g/ml），蛋白质色素复合物在595nm 波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可 用于蛋白质的定量测定。特点v蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合
2、在2min左右 的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其 结合物在室温下1h内保持稳定。v该反应非常灵敏，可测微克级蛋白质含量( 范围为5100g蛋白质）,，所以是一种比 较好的蛋白质定量法。二、材料、试剂与仪器设备： v植物材料：各种植物叶片及其他器官或离体 细胞培养物 实验器具：分光光度计；离心机；研钵； 离心管；移液管，试管等； 试 剂 1考马斯亮蓝试剂：2蛋白质标准溶液：390%乙醇；4.磷酸（85%，W/V）。 三、实验步骤v样品含量测定：v（1）称取鲜样0.5g，剪碎放入研钵中加少 量pH7.0缓冲液3ml研磨提取,再分别加 2ml,1ml清洗研钵和研棒两次,倒入离心管中 ，7000
3、rpm/min离心15分钟,把上清液倒入 一刻度试管中,记录体积。v（2）用移液管（或移液器）取上清液 0.1ml(若样品中的蛋白质含量低可取0.5ml 加5ml考马斯亮蓝，按照0100g/mL的标 准曲线求算蛋白质含量)，加入到10ml刻度 试管中，再加入5ml考马斯亮蓝试剂，充分 摇匀，5分钟后，在分光光度计595nm 处比 色。四、结果计算v样品蛋白质含量（g /g鲜重）= (CV/a )/W v式中： C查标准曲线所得每管蛋白质含量 （g /mL）；vV提取液总体积（mL）；va测定所取提取液体积（mL）；vW取样量（g）。五、注意事项1.在配制考马斯亮蓝时很容易看到絮状物出现 ，应用滤纸加以过滤，以免影响测定结果。 2.不同的植物可溶性蛋白含量相差很大，测定 时注意进行预试验，以确定所用的试液浓度 在标准曲线范围之内。
