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1、1.11.1 课题来源课题来源哈尔滨市科技局攻关项目1.21.2 研究的目的及意义研究的目的及意义水稻是世界上最重要的农作物之一，全世界有40%的人口以大米为主食。水稻种子蛋白质含量占粒重的7%10%，其中主要是谷蛋白(占胚乳总蛋白的60%以上)，其次是醇溶蛋白，且前者易被人体消化，后者则不能1。可以说，大米是人们(尤其是亚洲人)蛋白质的基本来源。据统计，日本人消费的蛋白质近19%来自大米。我国是发展中国家，消费水平较低，来自大米的蛋白质消费比例可能更高。大米蛋白是公认的优质植物蛋白，具有氨基酸组成平衡2。大米蛋白是一种低抗原性蛋白，不会产生过敏反应 ，美国临床研究表明，在700个遗传性过敏症
2、的病例中，高度过敏病人中对大米蛋白过敏的低于1%，而儿科过敏病人中很少对大米蛋白过敏。大米蛋白是公认的优质植物蛋白，具有氨基酸组成平衡合理和低过敏性等特点，适合作为婴幼儿和特殊人群的营养食品，国内外高度重视大米蛋白的研究和产品开发3。米谷蛋白是大米的主要储藏蛋白质，约占大米总蛋白质的80%以上。大米蛋白具有优良营养品质，主要表现在：(1)大米蛋白氨基酸配比较合理。大米蛋白氨基酸组成与小麦蛋白、玉米蛋白必需氨基酸组成及WHO推荐蛋白质氨基酸最佳模式(%)；(2)含赖氨酸高的谷蛋白占大米蛋白的80%左右，而品质差的醇溶蛋白含量很低。因此赖氨酸含量比其它一些粮食种子高；(3)生物效价高4-5。大米蛋
3、白的生物价为77，不但在各种粮食中居第一位（包括大豆） ，而且可以和白鱼(生物价76)，虾（生物价77）及牛肉（生物价77）相媲美；(4)大米蛋白的消化率为85%，高于马铃薯74%，玉米窝头66%等其它谷物，且不含胆固醇。按照Osborne6的分类方法,大米蛋白质可分为清蛋白(Albumin)可溶解于水的蛋白质(4% 9% )；球蛋白(Globulin)可溶于稀盐的蛋白(10%11% )；醇溶蛋白(Gliadin)可溶解于70%乙醇的蛋白质(3%)；谷蛋白(Glutenin) 可溶于稀酸或稀碱的蛋白质，其中水不溶性的谷蛋白占66%78%一些禾谷类种子内的碱溶性蛋白质，是稻谷中的主要贮存蛋白质，
4、占总蛋白质的80%90%，常与淀粉相互作用7。本文以大米蛋白中的米蛋白的分级分离和酶法修饰进行研究，采用淀粉酶法提取粗蛋白并对其进行纯化，重点提取谷蛋白,分析其组成,然后进行酶法修饰使其改性，提高米蛋白的功能性，然后对酶修饰后的米谷蛋白进行物化特性的研究。2.2大米蛋白的研究进展大米蛋白的研究进展2.2.1 蛋白质的功能特性蛋白质功能性质主要包括以下几个方面：（1）水合性质，取决于蛋白质与水的相互作用，如溶解性，持水性，粘度等；（2）表面性质，主要包括蛋白质乳化性和起泡性等；（3）蛋白质和蛋白质相互作用，体现在蛋白质凝胶作用和成膜性8。蛋白质的改性9就是人为地对蛋白质结构进行修饰。从分子水平看
5、，改性实质是切断蛋白质分子中主链或是对蛋白质分子侧链基团进行修饰，使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，从而引发蛋白空间结构和理化性质改变，使蛋白功能特性和营养特性得到改善10。2.2.2 物理改性蛋白质物理改性是指利用机械处理、热、挤压、冷冻、电、磁等物理作用形式，改变蛋白质的高级结构和分子的聚集方式。般不涉及蛋白质的级结构，主要用于蛋白的增溶和凝胶。Cherry11等发现通过冷冻保存，尤其当花生蛋白样品含有高浓度还原剂(二硫苏糖醇或 -巯基乙醇)时，会促进其部分理化性质发生变化，如溶解性、电泳性质、分子量、结构、位阻及其它功能性。叶荣飞12等研究得出，热诱导大豆蛋白聚集生成了可溶聚集体，使得
6、低浓度热处理后完全变性的 SPI 具有良好的溶解性。2.2.3 化学改性 化学改性方法，包括酰化、脱酰胺、磷酸化、糖基化(即美拉德反应)、共价交联、水解及氧化等方法。化学改性是指采用化学方法改变蛋白质结构、静电荷和疏水基团。可通过烃化(作用于Lys，Cys，Met，His和Try)、氧化(作用于Cys，Met，His和Try)、酰化(Lys和Tyr)、酯化和氨基化(作用于Glu和Asp)反应实现13。姚玉静等采用乙酸酐和琥珀酸酐对SPI进行化学改性，结果得出：在中性和弱碱性(pH 5. 09. 0)范围内，酰化明显提高了SPI的EAI（乳化性）和ES，琥珀酰化的改性效果优于乙酰化14。李瑜15
7、等用三聚磷酸钠对小麦面筋蛋白进行磷酸化改性，发现磷酸化小麦面筋蛋白溶解度、乳化度及稳定性、起泡性均比未改性前有极其显著的改善。卢寅泉等16用磺化苯乙烯阳离子树脂为强化剂对花生蛋白进行选择性催化脱酰胺，脱酰胺度与肽键水解度之比达32.4，提高了乳化能力、乳化稳定性、持水性和粘度。2.2.4 大米蛋白的淀粉酶法改性淀粉酶也是大米蛋白提取中常用的酶制剂。利用淀粉酶将大米淀粉降解为更易溶解的糊精和低聚糖，并通过离心或过滤的方法将其除去，相对提高沉淀物中的蛋白质含量。早期这种工艺缺点在于为了考虑淀粉糖浆(如麦芽糖浆等)的生产，液化不能过于彻底，否则使得上清液中产生过多的还原糖当量，降低了麦芽糖的产率，这
8、样造成高蛋白米粉的蛋白含量远低于大豆浓缩蛋白，再加上其较差的溶解性，限制了其应用范围17。但基于上述原理，研究者们使用了更加高效而稳定的液化酶直接作用于大米粉，取得较好效果。Morita18以大米粉为原料用高温液化淀粉酶在97下反应2 h后过滤除去糖类物质得到了蛋白质含量达90%以上的大米分离蛋白。Shih19-20利用淀粉酶在90处理大米粉，使蛋白质的含量达到65%，其后进一步应用葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶处理可使蛋白质含量达76%，而且蛋白质仍保持其完整状态。淀粉酶法提取的大米蛋白要比蛋白酶法提取的纯度高，但功能性质方面不是很理想，有待进一步研究改进。2.3 糖基化作用改性糖基化作
9、用改性2.3.1 理论基础从报道的文献看，糖基化反应主要是基于蛋白质分子中氨基酸侧链的氨基和糖分子还原末端的羧基之间的羧氨反应，即美拉德反应。美拉德反应是由法国生物化学家Louis Camille Maillard(1878-1936)于 1912 年发现。美国化学家 Hodge21于 1952 年首先提出了美拉德反应的网络系统分类图解，对该反应机理做了系统的论述。美拉德反应一般可以分为二个反应阶段，三条反应路线。随着研究的不断深入，许多科学家认为美拉德反应14-15可分成 3 个反应阶段，即初期(The earlystage)、中期(The advanced stage)和末期(The fi
10、nal stage)。在早期阶段，还原糖与氨基酸或蛋白质中的氨基缩合，形成席夫碱（Schiffs） ，经过糖-蛋白质酮胺结合物（Amadori）重排形成 Amadori 产物。在这一阶段，蛋白质与多糖的共价结合已经完成；在进展阶段，Amadori 产物降解形成大量裂解产物；在最终阶段，前面的裂解产物继续反应，生成褐色色素类黑精，同时发生蛋白质交联反应。影响美拉德反应的因素有 pH 值、温度、反应时间、相对湿度，离子强度等22。糖蛋白共价复合物的制备主要有两种途径23，一种是干热法制备多糖蛋白共价复合物，一种是湿热法制备单糖或双糖蛋白质共价复合物。3 主要研究内容主要研究内容3.1 淀粉酶法提取
11、大米蛋白方法研究3.2 大米蛋白的糖基化改性研究3.3 糖基化大米蛋白的结构表征3.4 糖基化大米蛋白物化性质研究4 研究方案研究方案4.1 大米各组分的测定4.1.1 水分的测定恒重法（GB/T5009.4-2003） 4.1.2 蛋白质含量的测定凯式定氮法(GB/T5009.3-2003)4.1.4 淀粉含量的测定淀粉酶解4.1.5 纤维素的测定重铬酸钾碘量法4.2大米蛋白的提取及分级4.2.1大米蛋白的提取通过单因素实验，研究淀粉酶法提取大米蛋白中的固液比、加酶量、酶解温度和酶解时间等因素的影响，再通过正交试验优化淀粉酶法提取大米蛋白的工艺24。具体步骤：大米粉碎(80目)并过筛加水调浆
12、糊化液化离心沉淀干燥大米浓缩蛋白称取米粉50g，80目过筛，加水搅匀，浆浓度达到30一35%，调节pH为6.5，加入定量的15000u/g的高温a-淀粉酶，用电炉快速加热到所需温度，再水浴恒温搅拌，到达设定时间后加2mol/L的HCI调pH至5.0灭酶，冷却，然后离心20min，用温水洗去沉淀物残余的糖，再离心20min，沉淀物于50烘20h，最后将大米浓缩蛋白粉碎过筛(40目)测定蛋白质含量。4.2.1.1固液比对大米蛋白提取率的影响采用固液比分别为1:2、l:3、1:4、1:5、l:6，加酶量为300u/g，酶解温度为80，酶解时间为90min，进行试验，测定大米蛋白的提取率。4.2.1.
13、2加酶量对大米蛋白提取率的影响的试验设计调整加酶量分别为75u/g、150u/g、225u/g、300u/g、 375u/g、450u/g、525u/g、600u/g。其余实验条件为：固液比1:4、酶解温度为80，酶解时间为90min，进行试验，测定大米蛋白的提取率。4.2.1.3酶解温度对大米蛋白提取率的试验设计采用高温a-淀粉酶的适宜温度为80100，分别在75、80、85、90、95、 100，固液比l:4，加酶量为450u/g，酶解时间为90min，测定大米蛋白提取率。4.2.1.4酶解时间对大米蛋白提取率的试验设计本试验分别采用在30min、60min、90min、120min、15
14、0min和180min，酶解温度为90，固液比1:4，加酶量450u/g进行，测定大米蛋白提取率。4.2.1.5正交试验法优选淀粉酶法提取大米蛋白最佳工艺条件结合单因素试验所得结论，通过固液比、加酶量、酶解温度和酶解时间等单因素试验，选取较好的因素水平进行正交试验，其因素水平如下(表3一1)4.2.2糖基供体的筛选分别选择安赛蜜、甜蜜素、葡聚糖、与蛋白进行共价反应，以溶解度、分散度，持水性为考察指标，初步筛选出糖基供体。4.2.3 米蛋白糖共价复合物的制备称取一定量蛋白，加去离子水使蛋白充分水化，用 0.1 mol/L NaOH 调 pH 至 12，然后加热到 50，磁力搅拌 30 min，于
15、室温下冷却，按一定配比以加入糖（总固形物含量 2.5%w/v） ，搅拌 30 min 后用 0.1 mol/L HCl 调 pH 至 9.5，再磁力搅拌 30 min，最后进行冷冻干燥，得到蛋白/糖混合物的冻干粉25。将冷冻干燥好的样品置于装有饱和 KBr 溶液（相对湿度为 79%）的干燥器内，反应控制在 40进行。在不同反应时间分别取样，测定复合产物的性质。4.2.4.不同反应条件对共价复合物功能性质的影响工艺参数包括蛋白/糖质量比、相对湿度、温度、pH、作用时间等，以溶解性为考察指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验，确定最优反应条件26。4.2.5.米蛋白糖复合物的分子组成与结构研究4
16、.2.5.1 电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）4.2.5.2 氨基酸分析称取适量的蛋白质样品于 10 mL 的水解管中，然后加入 6 mL 的 6 mol/L 盐酸溶液进行酸水解，抽真空封管后，在 1101水解 24h 以上，冷却后洗涤定容，过滤，蒸干。再加入 0.02 mol/L 的盐酸溶液在真空中放置 30 min，用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析27。4.2.5.3 表面疏水性测定采用 ANS 荧光探针法4.2.5.4 高效液相色谱分析样品处理：将不同反应时间得到的样品液冷冻干燥，称取一定量的冻干样用0.05mol/L pH 9.0 的缓冲液溶解（配制成 0.1%w/v 蛋白浓度的溶液） ，搅拌 2 h，于 7000 r/min 下离心 20 min，取上清液，用 0.45m 的微孔滤膜过滤，然后用微量注射器进样。流动相采用 0.05 mol/
