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1、 DBS22DBS22DBS22/019-2012吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测2013年 发布 2013年 实施吉林省卫生厅 发布前 言本标准根据 GB/T1.1-2000标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则的要求编写。本标准分为两种检测方法：第一法：单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法；第二法：MPN 计数法 。其中第一法适用于污染较严重的食品，第二法适用于单核细胞增生李斯特氏菌含量较低而杂菌含量较高的食品。本标准负责起草单位：吉林省疾病预防控制中心、长春市疾病预防控制中心。本标准负责起草人: 刘桂华、龚云伟、李月婷、赵薇1吉林省食品安全地方标准吉林省
2、食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测食品中单核细胞增生李斯特菌的定量检测1 范围 本操作程序规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）的定量检验方法。本操作程序适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。 2 设备和材料 除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 2.1 冰箱：25和-18。 2.2 恒温培养箱：301、361。 2.3 均质器。 2.4 显微镜：10100。 2.5 电子天平：感量0.1 g。 2.6 锥形瓶：100 mL、500 mL。 2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（
3、具0.1 mL刻度）。 2.8 无菌平皿：直径90 mm。 2.9 无菌试管：16 mm160 mm.。 2.10 离心管：30 mm100 mm。 2.11 无菌注射器：1 mL。 2.12 金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）。 2.13 马红球菌（Rhodococcus equi）。 2.14 全自动微生物生化鉴定系统。 3 培养基和试剂 3.1 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。 3.2 含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。 3.3 李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。 3.4 1%盐酸吖啶黄（a
4、criflavine HCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。 3.5 1%萘啶酮酸钠盐（naladixic acid）溶液：见附录A中A.3.2.1。 3.6 PALCAM琼脂：见附录A中A.4。 3.7 革兰氏染液：见附录A中A.5。 3.8 SIM动力培养基：见附录A中A.6。 3.9 缓冲葡萄糖蛋白胨水甲基红（MR）和V-P试验用：见附录A中A.7。 3.10 5%-8%羊血琼脂： 见附录A中A.8。 3.11 糖发酵管：见附录A中A.9。 3.12 过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。 3.13 李斯特氏菌显色培养基。 3.14 API listeria 10300生化鉴定试剂盒。2
5、第一法第一法 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法4 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图 1。10倍系列稀释检样 25 g(mL)样品+225 m L PBS或生理盐水稀释液， 均质选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，涂 布李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板典型菌落计数及确证试验报 告36 1 24 h48 h10倍系列稀释检样 25 g(mL)样品+225 m L PBS或生理盐水稀释液， 均质选取2个3个适宜的连续稀释度的样品匀液，涂 布李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板典型菌落计数及确证试验报 告36 1 24 h48 h
6、图 1 单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序5 操作步骤5.1 样品处理冷冻样品应在 45以下不超过 15 min 或在 25不超过 18 h 解冻，若不能及时检验，应 放于-15左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于 25冰箱保存，24 h 内检验。5.2 样品制备称取样品 25g，放入盛有 225mL PBS 或生理盐水的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器以 8000 r/min10000 r/min 均质 1 min2 min，或放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质袋中， 用拍击式均质器拍打 1 min2 min。若样品为液态，吸取 25
7、mL 样品至盛有 225 mL PBS 或生理 盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，作为 1：10 的样品匀液。5.3 样品的稀释吸取上述 1：10 的样品匀液 1 mL 加到装有 9 mL PBS 或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成 1：100 的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀 液。每递增稀释 1 次，换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头。5.4 样品接种3根据对样品污染状况的估计，选择 2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液） ，以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别入三块李斯特显色或
8、 PALCAM 琼脂培养基，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如李斯特显色或 PALCAM 琼脂培养基表面有水珠，可放在 2550的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。5.5 分离、培养在通常情况下，涂布后，将平板静置 10 min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱 361培养 1 h，等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，361培养 24 h2 h。如果菌落不典型,可继续培养至 48 h2 h 再观察。在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上，典型菌落为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈（其它品牌李斯特氏菌显培养基上的菌落特征按照产品说明书判定）。典型菌落在 PALCAM
9、 琼脂平板上为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。6 确证实验6.1 初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取 5 个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于361培养 24 h；同时在 TSA-YE 平板上划线纯化，于 301培养 24 h48 h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。 6.2 鉴定 6.2.1 染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌，大小为（0.4 m0.5 m）（0.5 m2.0 m）；用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。6.2.2 动力试验：李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。6.2
10、.3 生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和 MR-VP 试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表 1。 6.2.4 溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为 20 个25 个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，361培养 24 h48 h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明
11、溶血环。 6.2.5 协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于 301培养 24 h48 h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。46.2.6 可选择 API listeria 10300 生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。5表1 单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别7 结果计算7.1 典型菌落计数和确认7.1.1 选择有典型单核细胞增生李斯特氏
12、菌平板，且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：a）只有一个稀释度的平板菌落数在 20 CFU200 CFU 之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b）所有稀释度的平板菌落数均小于 20 CFU 且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c）某一稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d）若所有稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e）若所有稀释度的平板菌落数均不在 20 CFU200 C
13、FU 之间且有典型菌落，其中一部分小于 20 CFU 或大于 200CFU 时，应计数最接近 20 CFU 或 200 CFU 的稀释度平板上的典型菌落。以上按公式（1）计算。f）若 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU200 CFU 之间，按公式（2）计算7.1.2 从典型菌落中至少挑取 5 个典型菌落（小于 5 个全选） ，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，301培养 24 h2 h。菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷 单核细胞增生李斯 特氏菌 （L.monocytogenes ）/格氏李斯特氏菌 （L. grayi）/斯氏李斯特氏菌 （L. seeliger
14、i）/威氏李斯特氏菌 （L. welshimeri）/V伊氏李斯特氏菌 （L. ivanovii）/英诺克李斯特氏菌 （L. innocua）/V注：阳性；阴性；V反应不定。677.2 结果计数公式（1）：T = （1）CdAB式中： T样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数； A某一稀释度单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； B鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； C用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； d 稀释因子。公式（2）： （2）式中： T 样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌落数； A1第一稀释度（低稀释倍数）单核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； A2第二稀释度（高稀释倍数）单
15、核细胞增生李斯特氏菌典型菌落的总数； B1第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； B2第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数； C1第一稀释度（低稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； C2第二稀释度（高稀释倍数）用于单核细胞增生李斯特氏菌鉴定的菌落数； 1.1计算系数（如果第二稀释度单核细胞增生李斯特氏菌鉴定结果为 0，计算系数采用 1）； d 稀释因子（第一稀释度）。8 结果与报告 8.1 根据李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板上单核细胞增生李斯特氏菌的典型菌落 数，按7中公式计算，报告每g（mL）样品中单核细胞增生李斯特氏菌菌数，以CFU/g(mL)表示； 如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第二法第二法 单核细胞增生李斯特氏菌单核细胞增生李斯特氏菌 MPNMPN 计数法计数法9 检验程序单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法检验程序见图2检样25g(mL)+225mL LB1301，24h选取3个适宜连续稀释度的样品
