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1、1RNA 干扰分化抑制因子-1 基因表达对食 管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响作者：曾达武， 方明霞， 刘豫瑞【摘要】 目的 研究针对分化抑制因子-1 的 siRNA(si-Id-1)对人食管鳞状细胞癌(ESCC)细胞增殖和凋亡影响的可能机制。 方法 阳离子脂质体法介导 si-Id-1 转染 ESCC TE-1 细胞株，倒置荧光显微镜下观察细胞形态学变化并计算转染率，RT-PCR 检测 Id-1 的 mRNA 表达水平;免疫印迹法检测 Id-1 的蛋白表达水平;细胞增殖实验检测转染前后 TE-1 细胞增殖能力变化;流式细胞术检测各组细胞的周期变化和凋亡指数。 结果 si-Id-1 转染前后的 TE
2、-1 细胞株 Id-1 的 mRNA 和蛋白表达水平有明显差异(P0.05);转染后的 TE-1 细胞较其亲代细胞增殖能力降低，凋亡程度增强(P0.05);转染后的 TE-1 细胞周期停滞在 G0/G1 期，G1 期细胞数增多，S 期细胞数减少(P0.05)。 结论 利用脂质体将 si-Id-1 转染至 ESCC 的TE-1 细胞是切实可行的;si-Id-1 可以有效沉默 TE-1 细胞 Id-1 的表达，从而抑制ESCC 细胞增殖。 【关键词】 抑制因子，免疫; 癌，鳞状细胞; 食管肿瘤; RNA，小分子干扰; 细胞凋亡; 细胞增殖在我国，食管癌具有高发病率及高病死率，以手术为主辅以放射治疗
3、或化学治疗的综合治疗可提高患者生存率，但仍有 90%的患者死于转移和局部复发1，因此寻求新的切实有效的食管癌治疗方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitor of DNA binding or differentiation, Id-1)可在食管癌、肝癌等肿瘤中表达，参与肿瘤血管发生、促进肿瘤生长及转移2-4;而小分子干扰 RNA(small interfering RNA, 2siRNA)可有效沉默目标基因，而不影响正常基因5。该研究针对 si-Id-1 对人食管鳞状细胞癌(ESCC)TE-1 细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响，探讨其对 ESCC 增殖和凋亡影响的可能机制。1 材料与方
4、法1.1 主要试剂 Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(广州锐博生物公司)，人食管鳞状细胞癌 ESCC TE-1 细胞(上海拜力生物公司，ATCC 来源)，Trizol Reagent(美国Invitrogen 公司)，RT-PCR 试剂盒(美国 Fermentas 公司)，兔抗人 Id-1 多克隆抗体、Western 印迹荧光试剂(美国 Santa Cruz 公司)，CCK-8 试剂盒(日本同仁株氏会社产品)，Taq 酶(北京天庚生化公司)，Annexin V/PI 凋亡试剂盒(美国 Beckman 公司)。1.2 分组 空白对照组：正常培养 TE-1 细胞组;转染试剂
5、组：仅加入Lipofectamine 2000 组;转染对照组：转染非特异性序列 NContml-05815 的细胞组;转染实验组：转染 si-Id-1 组。1.3 方法1.3.1 TE-1 细胞培养和脂质体介导的 siRNA 转染效率 ESCC TE-1 细胞培养于含 10%FBS 的 RPMI 1640 培养液，于 37 、体积分数为 0.05 的 CO2 培养箱中培养，0.25%胰酶消化传代。以 105 mL-1 的细胞密度接种培养，细胞 80%融合后，用 Lipofectamine 2000 转染试剂进行转染。3 组 siRNA 均由广州锐博生物公司设计与合成。Si-Id-1-001(
6、19 bp)：5-UGA GCA AGG UGG AGA UUCU dTdT-333-dTdT ACU CGU UCC ACCU CUA AGA-5Si-Id-1-002(19 bp)：5-CAU GAA CGG CUG UUA CUC A dTdT-33-dTdT GUA CUU GCC GAC AAU GAGU-5Si-Id-1-003(19 bp)：5-GUU GGA GCUGAA CUC GGAA dTdT-33-dTdT CAA CCU CGA CUU GAG CCUU-5另外，本实验还将标记 FAM 的 siRNA 同时转染至 TE-1 细胞，分别于转染6，24，48 和 60 h
7、 后通过荧光倒置显微镜观察含有荧光的细胞所占比例以及转染前后的细胞形态变化，据此估计 siRNA 的转染效率。1.3.2 RT-PCR 检测 Id-1 的 mRNA 表达 用 Trizol 一步法提取 TE-1 细胞总RNA，聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，紫外分光光度计测纯度并定量。然后以 mRNA为模板，Oligo(dT)18 为引物，逆转录成 cDNA，反应总体积为 20 L，RT-PCR 反应条件为 42 孵育 60 min，70 中止 10 min。Id-1 的 PCR 反应引物由上海生物工程公司设计和合成，扩增片段大小为 416 bp。上游引物(Id1-P1)：5-CAG CAC GTC
8、ATC GAC TAC ATC A-3下游引物(Id1-P2)：5-GAA TCC CAC CCC CTA AAG TCT C-3以 -肌动蛋白(-actin)的一段扩增序列为内对照，扩增片段大小为 556 bp。上游引物(-actin-P1)：45-AAA GAC CTG TAC GCC AAC ACAG-3下游引物(-actin-P2)：5-TTT TAG GAT GGC AAG GGA CTT C-3反应体系：1PCR Buffer，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA 模板 200 ng，引物浓度 0.4 mol/L，Taq 酶 1.25 U，反应总体积 25 L。反应条件：94
9、预变性 5 min;94 30 s57 30 s72 45 s，共 30 个循环;72 最后延伸 7 min。最后的 PCR 扩增产物用凝胶图像分析系统进行灰度扫描。目的基因的表达指数=目的基因条带的积分密度值/内对照条带的积分密度值1.3.3 Western blot 法检测 Id-1 的蛋白表达 siRNA 转染 TE-1 细胞 60 h 后以RIPA 缓冲液 4 裂解 30 min，离心，取上清并采用 BCA 进行蛋白定量。各组采用同样的蛋白量上样，在 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。电泳后转膜，封闭液封闭 1 h，加 Id-1 抗体(11 000)4 过夜，洗去未结合的一抗，以 We
10、stern blot 试剂盒加二抗 DAB 染色。1.3.4 转染前后 ESCC 细胞的增殖 siRNA 转染 TE-1 细胞在 37 ，体积分数为 0.05 的 CO2 的培养箱内培养，24，48 和 72 h 分别停止孵育，并向相应的培养板孔内加入 10 g/L 的 CCK-8 溶液 10 L，继续培养 24 h。酶标仪在 450 nm 的波长条件下测定各孔吸光度值。 细胞生长抑制率=(对照组 OD 值-实验组 OD值)/对照组 OD 值1.3.5 流式细胞技术检测细胞周期和凋亡 siRNA 转染 TE-1 细胞 48 h，胰酶消化并收集各组细胞，离心，弃上清，PBS 洗涤，加缓冲液使其浓
11、度为 1106 mL-1，5取 100 L 细胞悬液于 5 mL 流式管中，加入 Annexin V/FITC 5 L 和 20 g/mL 的碘化丙啶溶液 10 L，混匀后于室温避光孵育 15 min，在反应管中加 400 L PBS，用 WinMDI 2.9 对结果进行分析处理。1.4 统计学处理 每组实验均重复 3 次，实验数据以 xs 表示，用 SPSS 15.0 软件分析。单因素方差分析采用 q 检验，以 P0.05 表示差别有统计学意义。福建医科大学学报 2009 年 11 月 第 43 卷第 6 期曾达武等：RNA 干扰分化抑制因子-1基因表达对食管鳞状细胞癌增殖与凋亡的影响2 结
12、 果2.1 Id-1 siRNA 转染至 TE-1 细胞后 Id-1 mRNA 的表达 转染后 2448 h 含绿色荧光的细胞数最多，60 h 后含绿色荧光的细胞数逐渐减少，提示 TE-1 细胞转染时间为 2448 h(图 1)。通过荧光标记 FAM 的阳性对照转染效率，可预测本实验siRNA 的转染效率80%。RT-PCR 聚丙烯酰胺电泳及凝胶图像分析系统灰度扫描结果均提示，空白对照组、转染试剂组和转染对照组 Id-1 mRNA 均存在表达，但各组间差别无统计学意义;3 组转染实验组 Id-1 mRNA 的表达水平明显降低，灰度扫描值与空白对照组比较差别有统计学意义(P0.05,图 2，表
13、1)。3 条序列在转染后 48 h 均发挥明显的 Id-1 基因的沉默效应，尤以 si-Id-1-001 最为明显。2.2 Id-1 siRNA 转染至 TE-1 细胞后 Id-1 蛋白表达水平 转染组细胞 Id-1 蛋白表达明显低于空白对照组、转染试剂组和转染对照组。Image-ProPlus 图像分析显示：si-Id-1 组细胞 Id-1 完全不表达，与空白对照组比较差别具有统计学意义(P0.05)(图 3，表 2)。62.3 CCK-8 法测定 Id-1 siRNA 干扰 Id-1 基因对 TE-1 细胞增殖的影响 转染后的 24，48 和 72 h 转染实验组细胞的吸光度值均显著低于空
14、白对照组、转染对照组和转染试剂组(P0.05)。表 1 Id-1 RT-PCR 平均灰度扫描比值表 2 Id-1 Western blot 平均灰度比值表 3 不同时间点 si-Id-1 对 TE-1 细胞增殖的抑制2.4 流式细胞技术检测 TE-1 细胞的细胞周期和细胞凋亡 与转染对照组、转染试剂组相比，转染实验组处于 G0/G1 期的细胞和处于 S 期的细胞比较差别均有统计学意义(P0.05)。Annexin/PI 双染法检测结果显示，空白对照组、转染对照组和转染试剂组的凋亡率较低，而转染实验组 TE-1 细胞的凋亡率为7.9%(P0.05，表 4)。表 4 siRNA 转染对 TE-1
15、细胞周期和凋亡的影响3 讨 论前期已对 Id-1 在 ESCC 组织中的表达作用做过研究，证实其具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡作用，是肿瘤发生、发展过程中的正调节蛋白6。而 RNAi 技术以其高稳定性、高效率性、高特异性及高传递性等特点，已成为肿瘤基因治疗的研究热点;靶基因的二级结构是影响 siRNA 沉默效率的主要因素之一，siRNA 的干扰活性与其和靶基因 mRNA 的可结合性密切相关，针对靶基因的不同序列，siRNA 的抑制作用差异很大7-8。将根据 RT-PCR 结果优选出来的 si-Id-1-001 进一步进行转染，并检测各组蛋白的表达，从转染后 Western blot 的结果分析
16、，发现转染组无 Id-1 蛋白表达，与对照组比较，差别具有统计学意义(P0.05)，这与 Li 等的研究结果一致9。上述结果表明，利用脂质体人工合成的 si-Id-1 是可行和有效的，可能为研究 Id-1 对食管癌细胞生物学特性的影响及其作用机制提供一个可靠的工具。采用 CCK-8 试7剂盒检测各组细胞的增殖能力，结果显示，转染 24 h 后 si-Id-1 组细胞增殖速度明显减慢，其增殖能力均受到抑制。可见，si-Id-1 的瞬时转染能显著抑制 ESCC 细胞的增殖速度，这一结果与 Hui 等的研究一致2。经流式细胞监测转染后 TE-1 细胞的细胞周期，发现转染试验组转染 48 h 后 G0/G1 期细胞比例明显增加，S 期细胞比例减少，由此可以推断 si-Id-1 可抑制人食管癌 TE-1 细胞从 G0/G1 期进入 S期，导致 G0/G1 期阻滞，细胞不能进入 S 期合成 DNA，从而达到抑制细胞快速增殖的作用。细胞增殖大多是由 DNA
