《HPLC法测定大鼠脑组织游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽及γ-氨基丁酸》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPLC法测定大鼠脑组织游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽及γ-氨基丁酸（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1HPLC 法测定大鼠脑组织游离天门冬氨酸、 谷氨酸、肌肽及 -氨基丁酸作者：宋杨，于涛，庞磊，刘影，韩璐，杨菁【摘要】 目的 建立测定大鼠脑组织中游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸含量的高效液相色谱法。方法 采用 C18 色谱柱，以乙腈和 25 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 6.8)为流动相，用邻苯二甲醛为柱前衍生剂，流速为 1 mL/min，激发波长为 338 nm，发射波长为 425 nm，在柱温 38下采用二元梯度洗脱，同时对大鼠脑组织中游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸的含量进行了测定。结果 天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸在该色谱条件下均可基线分离，
2、在0.56 g/mL 范围内呈现良好线性关系，天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸的相关系数分别是 0.9991,0.9998,0.9996,0.9995。回收率分别为99.80%,99.74%,99.63%,99.34%。结论 该方法灵敏可靠，专属性强，重现性好。天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸在大鼠脑组织中的含量分别为0.770.04、1.160.07、0.360.05、1.300.06 mg/g。 【关键词】 天门冬氨酸;谷氨酸;-氨基丁酸;肌肽;邻苯二甲醛Abstract： Objective To establish HPLC methods to determine f
3、ree Aspartate， Glutamate， Carnosine and GABA in brain.Methods The sample was derived from O- phthalaldehyde (OPA)， and then the derivative sample was separated on Kromail C18 column at 38. A linear gradient elution of A (0.025 mol/L phosphate buffer of 3% Acetonitrile， pH 6.8) and B (0.025 mol/L pho
4、sphate buffer of 50%Acetonitrile) was used， the flow rate was 1 mL/min， and detected by fluorescence detector with excitation wavelength (ex) at 338 nm and emission wavelength (em) at 425 nm.Results Aspartate， Glutamate， Carnosine and GABA were separated to baseline. A good linearity was obtained ov
5、er the range of 0.5 to 6 g/mL， and the correlation coefficients of Aspartate， Glutamate， Carnosine and GABA were 0.9991， 0.9998， 0.9996 and 0.9995， respectively，the recoveries were 99.34%99.80%. Conclusions 2The result shows that this method is simple， efficient， specific， and reliable. The contents
6、 of free Aspartate， Glutamate， carnosine and GABA in rats brain were (0.770.04)，(1.160.07)，(0.360.05)，(1.300.06) mg/g.Key words：Aspartate; Glutamate; GABA; fluorescence; O-phthalaldehyde谷氨酸(glutamate，Glu)、天冬氨酸(Aspartate，Asp)和 -氨基丁酸(-aminobutyric acid ， GABA)是哺乳类动物中枢神经系统内重要的氨基酸类神经递质。Glu、Asp 为兴奋性神经递质，
7、参与神经元通信到神经可塑性及神经病理异常等一系列病理生理过程1。GABA 为抑制性神经递质，其抑制效应在于防止兴奋性神经元过度兴奋2。肌肽(carnosine，Car)由肌肽合成酶利用 -丙氨酸和 L-组氨酸合成。尽管越来越多的研究表明，肌肽与多种疾病，如阿尔茨海默病3、脑缺血性疾病4等密切相关，但其在生物体内发挥的作用及含量的变化尚未清楚5。观察兴奋性神经递质和抑制性神经递质的变化以及肌肽含量的影响是将要研究的另一重要课题。为此建立了一种利用邻苯二甲醛(O-phthalaldehyde ， OPA)为衍生剂，选用常用 C18 柱来分离检测这四种物质的 HPLC 方法。结果表明该方法灵敏可靠，
8、专属性强，重现性好，适合用于检测脑组织中游离天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸。1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色谱仪(包括 LC-10Avp 泵、柱温箱、荧光检测器及柱温箱等)，日本岛津;KQ-250 超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;SONICS Uibra Cell VCX 105 型超声波粉碎机，美国;Mikro 22R 型冷冻离心机，德国。1.2 试剂与动物3天门冬氨酸(上海康达氨基酸厂)、谷氨酸(上海康达氨基酸厂) 、GABA(国药集团化学试剂有限公司)、肌肽和邻苯二甲醛(OPA)为 sigma 公司产品。乙腈为色谱纯;其余试剂均为国产分析纯。昆明种大鼠，体重 2402
9、60 g，雌雄各半，由辽宁医学院动物中心提供。2 方法与结果2.1 溶液的配置对照品溶液的制备 分别称取天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 GABA 对照品10.8、10.1、10.0 和 9.9 mg，混合加水稀释，即得 1.08、1.01、1.00 和 0.99 g/mL 的标准溶液，每 50 L 的标准溶液加 1 L 的三氟乙酸，配成对照溶液。供试品溶液的制备 取大鼠脑组织 20 mg 左右，加入纯水 500 L 后，超声粉碎 5 个循环，每个循环为 10 s，间隔 10 s，强度为 90%，再加入 10 L 的三氟乙酸，涡旋 2 min，以 12 000 r/min 离心 20 min，分离
10、上清，上清过 0.22 m 微孔滤膜，为供试品溶液。2.2 对照品与供试品的衍生化OPA 衍生化溶液的配制：称取 OPA 10.0 mg，加甲醇 1.0 mL，pH 11 的 0.04 mol/L 硼酸缓冲溶液 9 mL，二巯基乙醇 40 L，混匀避光保存。当日使用。衍生化方法：取对照品溶液 40 L，加入 OPA 衍生化溶液 40 L，混匀避光 2 min 内，取 10 L 进样。取供试品溶液 40 L，加入 OPA 衍生液 40 L，混匀避光反应，进样 10 L。42.3 色谱条件色谱柱：Kmmail c18(250 mm4.6 mm,5cm);流动相 A 为 3%乙腈的磷酸盐缓冲液(25
11、.0 mmol/L，pH=6.8)，流动相 B 为 50%乙腈的磷酸盐缓冲液，梯度洗脱(表 1)，流速 1 mL/min;荧光检测波长 425 nm，激发波长 338 nm。柱温：38 ;进样量 10 L。表 1 梯度洗脱条件 2.4 方法学研究2.4.1 专属性天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸对照品与供试品按照含量测定色谱条件进行实验，色谱图见图 1 和 2。表明供试品中杂质不干扰天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸含量的测定。2.4.2 标准曲线 稳定性 检测线取 6.00,4.00,2.00,1.00,0.75,0.50 g/mL 的混合对照品溶液，依法衍生后，各取10 L，
12、分别进行液相色谱仪测定，以对照品浓度(x，g/mL)为横坐标，以相应的峰面积(y)为纵坐标，进行回归分析，四种对照品的回归方程分别为：天门冬氨酸y=106x-71462，谷氨酸 y=106x-56537，肌肽 y = 413586 x - 1023.3，-氨基丁酸y=106x -48052。相关系数分别为：0.9991,0.9998,0.9996,0.9995。说明四种对照品天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸在 6.000.50 g/mL 内与峰面积呈良好的线性关系。2.4.3 回收率取已知含量的不同样品组织，分别准确加入对照品，制备供试品溶液，衍生化5后进行测定，结果见表 2。本法四种
13、对照品的回收率在 99.34%99.80%之间。表 2 对照品天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽以及 -氨基丁酸的回收率(n=3)2.5 大鼠脑组织中三种氨基酸含量的测定取大鼠脑组织 3050 mg，加入蒸馏水 500 L 后，超声粉碎 5 个循环，每个循环为 10 s，间隔 10 s，强度为 90% ，再加入 10 L 的三氟乙酸，涡旋 2 min，以 12 000 r/min 离心 20 min，分离上清，上清过 0.22 m 微孔滤膜，取 40 L 加入 OPA衍生液 40 L，混匀避光反应，进样 10 L。按外标法以峰面积计算四种氨基酸的含量，结果见表 3。表 3 大鼠脑组织中天门冬氨酸、谷氨酸
14、、肌肽以及 -氨基丁酸的含量(n=6)3 讨 论本法只用常用的 C18 色谱柱、双泵和荧光检测器，同时对大鼠脑组织中的天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽及 -氨基丁酸的含量进行了分离检测，方法简单易行。参考其他氨基酸的流动相分离条件，都是分别对天门冬氨酸、谷氨酸、肌肽及 -氨基丁酸进行了检测，并没用同时测定四种物质含量的可靠 HPLC 检测方法。本次实验主要是在流动相的配置和梯度的选择做了进一步的完善，此方法分离最佳，效果最优。【参考文献】1 吕辉，徐天乐.兴奋性氨基酸转运体研究进展J.中国药理学通报，2000,16(1)：22-23.2 万选才，杨天祝，徐永焘.现代神经生物学M.北京：北京医科大学中国
15、协和医科大学联合出版社，1999：158.63 Fonteh AN， Harrington RJ， Tsai A，et al.Free amino acid and dipeptide changes in the body fluids from Alzheimers disease subjects.Amino Acids,2007,32(2)：213-224.4 Dobrota D， Fedorova T， Stvolinsky S， et al.Carnosine protects the brain of rats and Mongolian gerbils against isch
16、emic injury： after-stroke-effect.Neurochem Res,2005,30(10)： 1283-1288.5 Bauer K.Carnosine and homocarnosine， the forgotten， enigmatic peptides of the brain.Neurochem Res,2005,30(10)： 1339-1345.6 丁永胜，牟世芬.氨基酸的分析方法及其应用进展.色谱，2004,22(3)：210.7 杨菁，吴国强，白剑.邻苯二甲醛柱前衍生化高效液相色谱法测定组织中肌肽含量.中国生化药物杂志，2009,30(4)：258-260.8 邓文红，沈应柏， 李镇宇，等.柱前衍生反高效液相色谱法测定马尾松针叶中 -氨基丁酸和 17 种游离氨基酸J.生态学报， 2008， 28(8)： 4023-
