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1、1HSV1 糖蛋白 B 基因疫苗体内表达的观 察【摘要】 目的 利用单纯疱疹病毒 1 型(HSV 1)糖蛋白 B 基因疫苗(pgB)免疫小鼠，观察 pgB 在小鼠体内的表达。方法 利用 pgB 肌肉接种方法免疫小鼠，通过免疫组化法检测免疫后 2、4、6 w pgB 在眼、三叉神经、脑表达 HSV 1 gB 情况。结果 免疫后第 2、4、6 w 均可见视网膜、三叉神经节、脑组织中大部分细胞核呈棕黄色，免疫组化呈阳性。结论 经肌肉免疫 pgB 能持续、稳定地在视网膜、三叉神经节、脑组织细胞中表达。 【关键词】 单纯疱疹病毒 1 型;糖蛋白 B ;基因疫苗;免疫组化单纯疱疹病毒 1 型(HSV 1)
2、感染眼部主要引起单纯疱疹病毒性角膜炎、急性视网膜坏死、虹膜角膜内皮综合征等。其中单纯疱疹病毒性角膜炎是当今世界上一种常见的主要致盲性眼病，近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用，其发病率有明显上升趋势，但其发病机制、治疗方法及 HSV 1 的潜伏形式、部位等，一直是眼科界棘手的问题。许多学者认为针对病毒的特异性自动免疫是控制 HSV 1感染的最有效途径，因此 HSV 1 疫苗是治疗和预防单纯疱疹病毒感染的重要研究方向。本研究利用已构建成功的 HSV 1 糖蛋白 B 基因疫苗(pgB)1进行免疫，初步观察其在动物体内的表达情况，为应用 pgB 进行治疗和预防 HSV 1 在眼部感染奠定基础。1
3、材料与方法1.1 材料 HSV 1SM44 株购自中国药检所疫苗三室，-70保存，病毒滴度 2TCID50 107.5/ml;Vero 细胞由长春生物制品所程晓庚教授惠赠;DMEM 培养基、15%胎牛血清、大肠杆菌 DH5 及真核表达质粒 pcDNA3(吉林大学第一医院中心研究室提供);重组真核表达质粒 pgB 由本研究的前期工作制备 1。健康 BALB/c 小鼠(购自吉林大学基础医学院动物实验室)，雌性，体重(182)g，46 w 龄。1.2 方法1.2.1 病毒的培养 Vero 细胞培养于含 100 ml/L 小牛血清的 DMEM 培养基中，单层细胞形成后，接种 HSV 1 SM44 病毒
4、原液 5 l(TCID50 107.5/ml)，病毒维持液含 10 ml/L 小牛血清的 DMEM，37培养。待细胞病理改变达到 60%左右时，收获病毒，并离心(2 000 r/min，5 min)，用上清检测 TCID50 和 PF 后标明，-70冻存备用2。1.2.2 质粒的大量提取 将转化有 pgB 及 pcDNA3 的大肠杆菌分别划板，在37恒温箱内过夜。挑取单菌落，置于 150 ml LB 液体培养基中，140 r/min、37过夜。质粒的提取严格按照无内毒素型质粒 DNA 大量纯化试剂盒(Vitagene)的说明书进行操作。将最终得到的质粒在紫外分光光度仪下测 OD260/OD28
5、0 和OD260。1.2.3 质粒的内毒素检测 提纯的质粒 pgB 和 pcDNA3 定量分析后，分别取出25 g 用无菌 PBS 稀释到 50 l，再与终浓度 3%氢氧化铝胶悬液 11(VV)混合，直至全部乳化，鲎试剂检测有无凝集反应。1.2.4 免疫小鼠3 BALB/c 小鼠随机分为 4 组，每组 30 只：A 组(实验组)注射含 pgB 的 PBS 溶液;B 组(阳性组)注射紫外线灭活的病毒液(UV HSV);C 组(载体对照组)注射含 pcDNA3 的 PBS 溶液;D 组(空白对照)只注射无菌 PBS(pH 7.4)溶3液。选取肌肉接种的方法。将小鼠双侧大腿内侧肌群用 750 ml/
6、L 酒精消毒，注射无菌 PBS 稀释的布比卡因(1.5 mg/ml)每侧 100 l。3 d 后进行同部位的多点注射免疫接种：每只鼠每次接种 100 g 质粒(溶于 0.2 ml 无菌 PBS 溶液)，质粒与终浓度 3%氢氧化铝胶悬液 11(VV)混合，直至全部乳化。间隔 3 w，重复接种 2 次;末次免疫 3 w 后检测。分别于末次免疫后 2、4、6 w 断髓处死小鼠 10 只，进行免疫组化检测。1.2.5 免疫组化检测4 取小鼠的眼球、三叉神经节及脑组织固定于 10%中性福尔马林液中 2448 h，常规行脱水、透明、浸蜡、包埋，切片。将包埋好的眼球标本，以平行于视神经矢状轴且以其为平面的视
7、网膜进行连续切片，厚约 5 m，放于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60温箱烤片过夜。切片用于视网膜VEGF 免疫组织化学染色(SP 法)检测。显微镜下观察并照相。2 结 果2.1 质粒大量提取结果 为免疫小鼠而大量提取的质粒 pcDNA3 及 pgB，经紫外分光光度仪测得 OD260/OD280 分别为 1.812 8 及 1.903 4。经鲎试剂检测无凝集反应。2.2 pgB 在小鼠体内表达的观察 免疫组化结果示：实验组与阳性组结果一致，免疫后第 2、4、6 周免疫组化结果均可见 HSV 1 gB 蛋白在视网膜、三叉神经节、脑组织中持续表达，大部分细胞核呈棕黄色，免疫组化呈阳性结果(见图
8、1)，说明接种重组质粒 pgB 后，pgB 在小鼠体内能表达 HSV 1gB 蛋白。而载体对照组和4空白对照组同阴性结果一致，未见视网膜、三叉神经节、脑组织细胞呈棕黄色改变(见图 2)，免疫组化结果为阴性。3 讨 论HSV 1 是双链线性 DNA 病毒，其感染在全世界非常普遍，不仅可产生原发性感染，而且还能产生潜伏感染和复发性感染。人群中约有 90%以上的人曾感染过 HSV 1，其危害已引起人们的广泛重视。HSV 1 是引起病毒性角膜炎、病毒性脑膜炎、口唇生殖器黏膜和新生儿感染的主要病原体。近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用和滥用，使 HSV 1 感染具有明显上升的趋势。 经过二十几年的不
9、断发展，HSV 1 感染的治疗已取得了明显的进步。从非选择性的竞争抑制病毒 DNA 酶的抗疱疹病毒类药物，到比较有选择性的病毒核苷激酶的抗HSV 1 药物;再加上干扰素及不同类型的抗病毒药物的联合应用，使 HSV 1 感染的发生控制在较低的水平。但由于抗生素、激素的不合理使用，病毒耐药株的不断出现，机体的免疫功能受到干扰，一些药物全身应用时对肝肾功能、造血系统的影响，以及对 HSV 1 潜伏机制尚不清楚等，使其在临床应用时受到限制，迄今还未达到理想的治疗效果5。目前针对 HSV 1 的感染尚无特效疗法，核苷酸类似物及其磷酸衍生物是病毒复制的抑制剂，但不能有效地抑制 HSV 1 的复发感染，国内
10、外许多学者认为针对病毒的特异性自动免疫是控制 HSV 1 的最有效途径。因此 HSV 1 疫苗是治疗和预防单纯疱疹病毒感染的重要研究方向6。根据感染特点，可将 HSV 1 疫苗分为抗原发性感染的预防性疫苗和抗复发性感染的治疗性疫苗。HSV 1 疫苗按其特点和作用机制可分为灭活病毒疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、肽疫苗、活载体疫苗和核酸(基因)疫苗7。基因疫苗是近十5几年才发展起来的一项新的生物技术，其作为第三代疫苗的地位已得到了确认。基因在体内的表达及诱生免疫反应的过程，模拟了自然状态下机体感染外源性病原微生物表达抗原及诱导免疫的过程，可以诱导机体全面的细胞免疫和体液免疫应答，在胞内寄生病原体的
11、疫苗防治上具有广阔的应用前景8。基因疫苗的具体免疫机制尚不十分清楚，但根据目前的研究资料来看，基因疫苗免疫机体后在细胞内表达，合成的抗原蛋白既可以诱导 MHC 限制的 CD8+细胞毒性 T 细胞应答9，也可以诱导 MHC 限制的 CD4+T 细胞应答。同时，也有一部分抗原多肽直接呈递给 B 细胞，引发特异性体液免疫应答10。本研究利用经鉴定已构建成功的基因疫苗 pgB 免疫接种小鼠，进行了初步的动物实验，确定 pgB 能否在动物体内正确表达，是决定 pgB 能否作为基因疫苗的关键。DNA 疫苗接种方式的不同决定了不同的转染效率和抗原递呈效率。对于疫苗接种的途径，一些学者认为眼周局部接种疫苗引起
12、的眼部保护作用优于系统免疫(肌肉免疫接种)11，而另一些学者认为重组杆状病毒表达系统表达的 HSV 1 gD 和 gB 蛋白疫苗的系统免疫不仅可减少潜伏感染和复发感染，而且能有效的抑制病毒在体内潜伏12。此外，还有研究结果显示疫苗在病毒攻击实验中有效的免疫保护作用与接种途径无关，多种不同的免疫反应参与抗 HSV 1 的感染中，CD4+和 CD8+在预防眼部 HSV 1 感染中都起了一定的作用。诱导的免疫也取决于免疫途径，一般来讲，肌肉注射是有效的，可以产生良好的保护作用，肌肉注射应用最早也最广泛13。本实验采用的是肌肉注射法，在视网膜、三叉神经节、脑组织都分别检测到了有 HSV 1 gB 蛋白
13、的表达。本实验初步证实了肌肉免疫可使 pgB 在眼内、三叉神经节及脑组织可持续、稳定表达，为今后 pgB 在基因治疗方面进行深入地研究奠定了基础。6【参考文献】1 孟祥俊,贺 冰，冯 非，等.单纯疱疹病毒 1 型糖蛋白 B 基因疫苗的构建J. 吉林大学学报(医学版)，2004;30(5)：717 20.2 傅继华.病毒学实用实验技术M.山东科学技术出版社，2000：60 70.3 Ferenczy MW. Prophylactic vaccine strategies and the potential of therapeutic vaccines against herpes simple
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