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1、1JNK 在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的 表达及依达拉奉对其的影响作者：陆海燕，邓小龙，李光乾，李伟【摘要】 目的 ：研究(JNK)在惊厥持续状态(SC)幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响。方法：雄性 SD 幼年大鼠 120 只分为正常对照组(NC 组)、惊厥持续状态组(SC 组)、依达拉奉组(EDA 组)三大组;各大组均随机分为 5 组，分别于惊厥后4、12、24、48 和 72 h 处死。采用氯化锂-匹鲁卡品法制作惊厥持续状态模型。EDA组在大鼠造模前三天予 EDA 腹腔注射，每天注射一次，连续 3 d。TUNEL 法检测观察大鼠海马细胞凋亡情况;免疫组化法检测海马 p-JNK 蛋白
2、表达动态变化;RT-PCR 技术检测海马 JNK1 mRNA 表达的动态变化。结果：SC 组在惊厥 12 h 后的各时间点海马 CA1 区 TUNEL 阳性细胞数均显著高于 NC 组(P0.01)，而 ED组 TUNEL 阳性细胞数均较 SC 组显著下降(P 0.01 或 P 0.05)。幼年大鼠海马 CA1 区 p-JNK 蛋白在 SC 组表达显著增强，与 NC 组比较差异有显著性(P 0.01)，在 EDA 组表达较 SC 组明显下降(P 0.01)。SC 组海马 JNK1 mRNA表达明显高于 NC 组(P 0.01)，而在 EDA 组 JNK1 mRNA 的表达较 SC 组显著降低(P
3、 0.01)。结论：SC 可诱导 JNK 的表达，促进 SC 后海马神经元凋亡;EDA预处理可以影响 JNK 的表达，减轻惊厥后海马神经元凋亡程度。 【关键词】 惊厥;脑损伤;幼年大鼠;JNK;依达拉奉Abstract: Objective: To observe the change of JNK in the hippocampus of status convulsive rat and the regulation effect of EDA on it. Methods: One hundred and twenty male Juvenile Sprague-Dawley(SD)r
4、ats were randomly divided into normal control group (NC)， status convulsivus group (SC)， and edaravone group (EDA);2and every group were randomly divided into five groups， which would be executed at 4 h，12 h，24 h，48 h and 72 h after convulsion discontinued. Status convulsivus (SC) was induced by inj
5、ecting Lithium Chloride and Pilocarpine. Group EDA were injected EDA before convulsion，and repeatedly every day for 3 days. The expression of apoptosis cells were observed with TdT-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)， the changes of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains were detected with
6、 immunohistochemistry(IHC)，the expression of JNK1 mRNA were detected with RT- PCR. Results: The TUNEL positive cells in hippocampus CA1 of SC group were more than that of NC group at 12 h after the SC(P 0.01). After the intervention of edaravone，TUNEL positive cells showed a significant drop (P 0.01
7、 or P 0.05). The expression of p-JNK protein in the hippocampus CA1 domains increased markedly in SC group. The difference was statisticaly significance compared with NC group (P 0.01)， and EDA group was much lower than SC group (P 0.01). The expression of JNK1 mRNA in the hippocampus in SC Group wa
8、s much higher than NC Group (P 0.01)，and EDA group was significantly lower than SC group(P 0.01). Conclusion: SC maybe increase the expression of JNK， JNK may be mediated to cell apoptosis. EDA can effect the expression of JNK， and lessen the pothology of hippocampus.Key words: convulsion;brain inju
9、ry;juvenile rat;JNK;edaravone惊厥是小儿时期较常见的急症。当惊厥反复发作而未能很好控制时，可导致进行性脑损伤，并可造成认知损害1。多种因素导致神经元坏死和细胞凋亡是惊厥性脑损伤的基本原因。JNK(C-Jun N 端激酶)是凋亡途径中重要的信号分子，已有部分学者对其参与神经元凋亡的情况做了研究。然而在惊厥持续状态(status convulsive，SC)后的表达情况目前尚未见相关报道。依达拉奉(edaravone，EDA)对低氧缺血性脑病的神经元保护作用已得到证实2，但其对于 SC 后 JNK 的表达及神经元凋亡的影响情况，国内外尚未见报道。本实验通过建立氯化锂-匹
10、鲁卡品SC 大鼠模型，观察幼年大鼠海马 p-JNK 蛋白及 JNK1 mRNA 表达的变化，及依达拉奉对 SC 后海马 JNK 表达及神经元凋亡情况的影响，初步探讨 JNK 与惊厥性脑损伤的关系及依达拉奉在 SC 幼鼠中可能的神经元保护机制。1 材料和方法31.1 实验动物和试剂 清洁级健康幼年雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠(购自中国科学院上海分院试验动物中心)120 只，体重 5070 g。氯化锂、匹罗卡品购自美国 Fluka 公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。鼠抗 p-JNK 单克隆抗体购自美国 Stancru 公司。M-MuLV 第一链 cDNA 合成试剂盒购自上
11、海生工生物工程技术服务有限公司，依达拉奉由南京先声东元制药有限公司资助。1.2 实验分组和 SC 动物模型的建立 随机将 SD 大鼠分为正常对照组(NC 组)、惊厥持续状态组(SC 组)、依达拉奉组(EDA 组)三大组，每组 40 只大鼠;各大组再随机分为 5 小组，分别于惊厥后 4、12、24、48 和 72 h 处死。若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足 8 只的，按随机原则补足。采用氯化锂-匹鲁卡品法制作SC 模型。SC 模型制作参照胡越等3方法。惊厥按 Racine 分级标准分为 V 级，惊厥发作达到 IV-V 级，持续时间至少 30 min，惊厥解除后状态良好的大鼠为合格SC 大
12、鼠模型。NC 组：不作任何处理。EDA 组：造模前 3 d 予 EDA 3 mg/kg 腹腔注射，每天注射一次，连续 3 d，其余用药同 SC 组。1.3 动物标本的制备 大鼠分别于惊厥后各时间点处死。经 10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔麻醉后，断头剥离颅骨，完整取出脑组织置于冰盘上，分离右侧海马脑组织，放入去 RNA 酶的 EP 管中，迅速置于液氮中保存。左侧大脑在垂直视交叉处离断，并冠状位向后切取约 5 mm，放入预冷的 4%多聚甲醛固定 12 h，入 70%乙醇，送病理科进行石蜡包埋;石蜡包埋后制片，切片厚度为 5m。1.4 实验方法1.4.1 TUNEL 检测凋亡细胞：具体操作
13、步骤参照试剂盒说明书。二氨基联苯胺4(DAB)显色，中性树脂封片。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞;光镜下每组各选阳性细胞最集中的 5 个高倍视野，计算出每个高倍视野的阳性细胞数，取其平均值。1.4.2 免疫组织化学检测 p-JNK 蛋白表达：石蜡切片融蜡水化后，用 EDTA 进行抗原修复，滴加 50L 鼠抗 p-JNK 抗体(1:100)4 过夜后滴加二抗，DAB 显色，中性树脂封片。显微镜下观察，阳性细胞为胞核中出现棕黄色。每张切片随机选择 5 个镜下视野(200)，应用 image-pro plus 6.0 图像分析软件测定阳性部位的平均光密度(optical d
14、ensity，OD)，以代表阳性部位的蛋白表达水平。1.4.3 RT-PCR 技术检测 JNK1 mRNA 表达：引物设计和合成。检索 GenBank数据库中 rat JNK1、GAPDH 的 mRNA 序列，利用 primer premier 5.0 软件设计引物，然后经过 Blast 匹对，由上海生工生物工程有限公司合成，用前法稀释成 10 pmol/L，引物序列及预期 PCR 产物长度如下(见表 1)。总 RNA 的提取。采用Trizol 一步法抽提海马总 RNA 提取，一切操作步骤均按 Trizol 试剂盒说明书进行。cDNA 的合成。应用 M-MuLV 第一链 cDNA 合成试剂盒，
15、一切步骤均按说明书进行。PCR。采用单基因扩增法，配制 20L PCR 反应体系，然后经 PCR 扩增，PCR 扩增条件：94 预变性 5 min，94 变性 30 s，56 复性 30 s，72 延伸 40 s，34 个循环，最后经 72 延长 8 min。以 GAPDH 为内参照。图像分析。产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳后，用 FR-980 生物电泳图像分析系统获取凝胶图像，观察分析 JNK1 mRNA 的转录情况，测定 PCR 产物电泳条带扫描灰度值。以GAPDH 作为内参照进行半定量分析比较，以其比值进行统计学分析。1.5 统计学处理方法 多组比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用
16、5LSD-t 检验，两变量的相关采用直线相关分析法分析。2 结果2.1 各组大鼠海马 CA1 区 TUNEL 阳性细胞表达结果(见图 1) TUNEL 结果显示，TUNEL 阳性细胞主要在神经元及神经胶质细胞，胞核中出现棕黄色颗粒，形成典型的“指环状”或“半月状”的细胞凋亡特征。SC 组海马 CA1 区 TUNEL 阳性细胞于惊厥后 4 h 已有少量表达，48 h 达高峰，之后有下降趋势;其 24、48、72 h 三个时间点均明显高于 NC 组(P 0.01)。EDA 组 24、48 和 72 h 时间点 TUNEL 阳性细胞表达水平较 SC 组均明显降低(P 0.01);但仍高于 NC 组(P 0.01)(见表 2)。2.2 大鼠海马 p-JNK 蛋白免疫组化结果(见图 2) 免疫组化结果显示，NC 组 p-JNK 蛋白在神经元和神经胶质细胞的胞核少量表达。SC 后 4 h 海马 CA1 区 p-JNK 蛋白表达即开始增加，48 h 达高峰，72 h 下降。而 EDA 组惊厥后各时间点海马 p-JNK 蛋
