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1、1Id3 基因在心肌营养素 1 促心肌成纤维 细胞增殖中的作用作者：周瑞红 李菊香 夏子荣 颜素娟 谭秋波【摘要】 目的 探讨在高静水压条件下分化抑制因子 3（inhibitory of differentiation 3，Id3 )基因在心肌营养素 1 (cardiotrophin 1，CT 1 ) 促心肌成纤维细胞增殖中的作用。方法 34 代心肌成纤维细胞用于实验，分为对照组( C 组)、CT 1 反义寡核苷酸组 (ASODN 组) 、 正义寡核苷酸组 ( SODN 组)、高静水压组( P 组)。利用自制压力培养装置，将各组细胞置于 160 mmHg 压力下培养 8 h。CT 1 活性通过
2、 Western 印迹法分析测定，Id3 基因表达通过 RT PCR 方法测定，MTT 测定心肌成纤维细胞增殖 。结果 高静水压明显促进心肌成纤维细胞增殖 ，CT 1 表达上调，Id3 mRNA 表达增加；CT 1 ASODN 干预后能抑制高静水压所致的细胞增殖，CT 1 表达下调，Id3 mRNA 表达减少。结论 Id3 mRNA 在心肌成纤维细胞中有明显表达，且与 CT 1 促心肌成纤维细胞增殖密切相关。 【关键词】 心肌营养素 1 ；心肌成纤维细胞 ；分化抑制因子 3近年有研究发现心肌营养素 1 ( CT 1 )与高血压心室重塑有一定的关联，在12 周龄的自发性高血压大鼠(SHR)的肥厚
3、心室肌中，CT 1 mRNA 明显升高1。另有研究发现，内源性或外源性的 CT 1 能刺激成纤维细胞合成 DNA 及胶原，促进成纤维细胞生长2 。分化抑制因子（Id）3 作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现，其基因由 3 个外显子和 2 个内含子组成3。Id3参与多种细胞生物学过程，包括骨骼肌的分化、血管平滑肌的增殖、胚胎的神经形2成、骨和血管发生等47，表明 CT 1 与 Id3 均存在于成纤维细胞中，且都有促进细胞增殖的作用，但他们之间是否存在某种联系，Id3 在心肌成纤维细胞中的表达情况及 CT 1 促心肌成纤维细胞增殖的作用是否与 Id3 有关尚未见报道。1 材料与
4、方法1.1 材料出生 13 d 的 SD 乳鼠(南昌大学医学院医学实验动物科)；RT PCR 试剂（Promega，USA）；Trizol( Invitrogen，USA)；DEPC，二甲基亚砜（DMSO)（Ameresco，USA）； DL2000 DNA Ladder Marker (上海生工) ；MTT 增殖检测试剂盒(Sigma，USA) 。1.2 方法1.2.1 心肌成纤维细胞的原代培养及鉴定在无菌条件下摘取 45 只大鼠心脏， 分离心室利用蛋白酶消化心肌组织， 差速贴壁法获得原代心肌成纤维细胞。第 34 代细胞用于实验。鉴定方法参照文献9。1.2.2 CT 1 反义链与正义链的设计
5、与合成以硫代磷酸修饰反义和正义寡核苷酸链，由上海生物工程有限公司合成，各自序列为：CT 1 反义寡核苷酸链(ASODN)：5 TGGCTCATGCTGGCCCCAGGCTGAT 3； CT 1 正义寡核苷酸链(ASODN)：5 ATCAGCCTGGGGCCAGCATGAGCCA 3。1.2.3 实验分组及干预措施 3空白对照组(C) ：大气压下培养； 高静水压组(P) ：160 mmHg 压力下培养 8 h9；CT 1 反义寡核苷酸组(ASODN 组)：160 mmHg 压力培养下，加入终浓度为 10 molL 的 ASODN；CT 1 正义寡核苷酸组(SODN)：160 mmHg 压力培养下
6、 8 h，加入终浓度为 10 molL 的 SODN。1.2.4 RT PCR 法检测 Id3 mRNA 的表达按照 Trizol 试剂说明书提取心肌细胞总 RNA。参照 Promege 公司提供的RT PC 试剂盒说明书进行逆转录反应， PCR 反应共 35 个循环。引物设计由 Gen Bank 中获取目的基因全序列，借助 primer primier 5.0 软件设计完成，由上海生工合成，各引物序列（含参照序列和目的序列）见下 ： actin 正义5 GTAAAGACCTCTATGCCAACA 3；反义5 ACTCATCGTACTCCTGCTTG 3,240 bp。Id3 正义5 CATC
7、TCCCGATCCAGACA 3；反义5 TCATAATCAGGGCAACAGAG 3；494 bp。1.2.5 蛋白表达的检测Western 印迹法检测细胞裂解液中 CT 1 蛋白表达情况，用 Lab Work 3.0 UVP 软件分析条带的积分吸光度值， 相对蛋白含量用积分吸光度值表示。1.2.6 心肌成纤维细胞增殖检测( MTT 法)在各种条件培养下的 96 孔板实验结束前 4 h ，每孔加入 5 gL 的 MTT ( 四氮唑盐) 20 l，实验结束后，弃去各孔中的培养基， 每孔加入 DMSD 150 l，振4荡 10 min，酶标仪测 490 nm 吸光度。1.3 统计学处理实验数据以
8、 xs 表示，应用 SPSS12.0 软件。组间比较采用独立样本 t 检验，多组均数间比较采用单因素方差分析( ANOVA) ，两组均数间比较采用 LSD 检验。 2 结 果2.1 高静水压对心肌成纤维细胞 Id3 mRNA 表达的影响在 160 mmHg 高静水压下，Id3 mRNA 表达明显增加(P0.05)；ASODN 组Id3 mRNA 的表达明显低于 P 组和 C 组(P0.05)；SODN 组与 P 组相比无显著差异(P0.05)。见图 1，表 1。2.2 高静水压对心肌成纤维细胞 CT 1 蛋白表达的影响在 160 mmHg 高静水压下，CT 1 蛋白表达明显增加(P0.01)；
9、ASODN 组CT 1 蛋白表达明显低于 P 组(P0.01)；SODN 组与 P 组相比无显著差异(P0.05)。见表 1，图 2。表 1 各组 Id3 mRNA、CT 1 蛋白表达灰度值及心肌成纤维细胞增殖（mTT 法）比较(略)2.3 MTT 检测 CT 1 的 ASODN 对高静水压刺激成纤维细胞的影响成纤维细胞经 160 mmHg 的压力作用 8 h 后，明显增殖(P0.05) ，CT 1ASODN 能抑制高静水压所致的细胞增殖(P0.05)，而 CT 1 SODN 组对高静水压的促细胞增殖作用无影响，表 1。53 讨 论CT 1 主要存在于心脏组织中，是心脏正常生长、发育所必需的物
10、质。心肌细胞和成纤维细胞都能表达 CT 1，且心肌中 CT l mRNA 浓度和蛋白水平在 Dahl盐敏感大鼠的左室肥厚阶段和充血性心力衰竭阶段均明显增高。另有研究发现，内源性或外源性的 CT 1 能刺激成纤维细胞合成 DNA 及胶原，促成纤维细胞生长。因此 CT 1 在心室重塑（包括心肌成纤维细胞增值、心肌细胞肥大、胶原沉积等）中发挥重要作用，而其作用途径尚有待进一步研究。Id 又称 DNA 结合抑制因子( inhibitor of differentiationDNA binding)，包括 Id1Id4，属于螺旋 环 螺旋( HLH) 转录因子家族成员之一，主要通过与 A 类碱性 HLH
11、( bHLH) 蛋白(如 E蛋白) 结合而发挥作用；因其本身缺乏 DNA 结合必需的碱性氨基酸序列，Id 蛋白和 E 蛋白结合形成异二聚体后能够阻止 E 蛋白和其他 bHLH 蛋白结合，对 bHLH转录因子活性起负调节作用810。Id3 作为血清诱导的立即早期基因在小鼠成纤维细胞系中被首次发现，其表达受多条信号转导途径的调控，诱导 Id3 表达的因素有：血小板衍生生长因子、甲状腺刺激素、表皮生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白、转化生长因子、肿瘤坏死因子等，不同的刺激因素作用于不同的组织细胞，通过不同的信号途径，可导致 Id3 表达水平不同程度的升高或降低，其表达呈细胞特异性和双向调节性。
12、因此 Id3 参与多种细胞生物学过程，包括骨骼肌的分化、血管平滑肌和肿瘤细胞的增殖、胚胎的神经形成、骨和血管发生等47。笔者以往的研究发现心肌成纤维细胞在 160 mmHg 高静水压下培养 8 h 后，与对照组相比心肌成纤维细胞达到最大增殖效果11，本研究发现在此条件下 CT 1的表达亦明显增加，同时发现 Id3 mRNA 在心肌成纤维细胞中也有明显表达；当6使用 CT 1ASODN 干预后，心肌成纤维细胞增殖明显减弱，CT 1 的表达明显减少，Id3 mRNA 在心肌成纤维细胞中的表达也明显下调，这表明 CT 1 的作用与Id3 mRNA 的表达有关；而使用 CT 1 SODN 干预后，心肌
13、成纤维细胞增殖、CT 1 和 Id3 mRNA 的表达均无明显变化，由此推断 Id3 可能也在 CT 1 促心肌成纤维细胞增殖或者促心肌重塑过程中发挥作用。【参考文献】1 Takimoto Y，Aoyama T，Iwanaga Y，et al.Increased expression of cardiotrophin 1 during ventricular remodeling in hypertensive ratsJ. Am J Physiol，2002；282(3)：H896 H901 .2 Tsuruda T，Jougasaki M，Boerrigter G，et al.Cardio
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