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1、西南 国防医药 2 0 1 4年 2月第 2 4卷第 2期 石蜡包埋脱钙骨组织 中结核杆菌 D N A不 同提取方法 比较 潘鑫艳 ， 王丽， 杨长绍 ， 黎贵芸 ， 杨举伦 ， 蔡琳 摘要 目的探讨石蜡包埋的1 0 硝酸脱钙骨组织中简易有效的结核杆菌 D N A提取方法并进行验证。方法 以 2 0 例石蜡包埋、 1 0 硝酸脱钙的坏死性 肉芽肿炎疑为骨结核的组织标本为研究对象 ， 常规法直接采用德 国 Q I A G E N公司的 Q I A a m p D N A F F P E T i s s u e K i t 方法提取 D N A， 而改良法中加入 Q I A a m p D N A
2、 Mi c r o K i t 试剂盒中的 c a r r i e r R N A， 以两种方法 分别提取 2 0例标本中结核杆菌 D N A， 通过荧光定量 P C R， 比较常规试剂盒提取法和改 良提取法对结核杆菌检测结果的影响。 结果改良法提取的D N A ( 3 5 3 2 3 4 8 ) n g t x 1 比常规法 ( 6 6 8 3 7 2 ) n g t x 1 提取的 D N A显著增多( P0 。 0 5 ， 表 1 ) 。 表 1 两种方法提取 的 D N A浓度和纯度 比较 注 ： 与常规法 比较 ， P 0 O 1 2 2 荧光定量 P C R检测结果常规法组 2 0
3、例脱钙 骨组织中， 3 例结核分枝杆菌阳性， 阳性率为 1 5 ； 而改 良法组中检测 出 1 1 例结核杆菌 阳性 ， 阳性率为 5 5 。 改良法组结核分枝杆菌检出率明显高于常规组 ( P 0 0 1 ) 。同时， 常规法组荧光定量 P C R检测 C t 值均在 3 8左右， 处于判读临界值 而改良法组 c t 值为 3 4 左右 ， C t 值明显小于常规法组 扩增曲线也明显高于常规法 组 ， 提示改良法提取脱钙骨组织中结核杆菌 D N A的扩 增效率优于常规组( 图1 ) 。 3讨 论 1 9 8 9年 ， H a n c e等 将 P C R技术用于结核分枝 杆菌的检测 ， 近年来
4、 ， 越来越多 的文献 _ 6 报道 了 用荧光定量 P C R方法检测石 蜡包 埋组织 中的结核 分枝杆菌。而大部分都是针对石蜡包埋 的肺 、 淋 巴 结 、 胸腹膜等骨外组织。但是 ， 结核杆菌可侵犯全身 各器官 ， 当累及骨组织时就会发生骨结核病。 骨组织不同于一般 的软组织 ， 是一种坚硬 的结 缔组织 ， 由黏多糖和一些胶原纤维样骨胶纤维构成 的骨样组织和沉着于其中的无机盐( 骨盐) 形成 的。 无机盐 以羟基磷 灰石结 晶的形式存在 ， 其 中绝大部 分为水合磷酸钙， 此外还包括微量碳酸盐和柠檬酸 图 1 不同方法提取石蜡包埋脱钙骨组织中 D N A经荧光定量 P C R检测结核杆
5、菌结果 左： 常规法提取石蜡包埋脱钙骨组织中D N A， 经荧光定量P C R检测结核杆菌的扩增曲线； 右： 改良法提取石蜡包埋脱钙骨组织 中 D N A， 经 荧光定量 P C R检 测结核杆 菌的扩增曲线 1 6 2 西南国防医药 2 0 1 4年 2月第 2 4卷第 2期 盐等 1 0 - 1 1 。因此 ， 骨组织及钙化病灶经福 尔马林 固 定后 ， 必须先将钙盐除去使组织软化 ， 才能进行后续 制片及其他分子检测 ， 常规脱钙液是 1 0 的硝酸。 硝酸是临床病理活检 中最实用的一种 常规脱钙剂 ， 脱钙迅速 、 完全可靠、 作用强 、 时间短 、 效果好 ， 但是 对骨组织的破坏作
6、用较大 ， 导致 D N A的降解。 本研究针对脱钙的骨组织 ， 选取适合的 D N A提取方 法 ， 用荧光定量 P C R方法检测结核杆菌。 经福尔马林 固定石蜡包埋过 的组织 中， D N A碱 基对问核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联 引， 这 种福尔马林介导 的甲基化直接影 响 D N A提取的效 率。Wa r f o r d等 也发现 ， 单细胞悬液经 3 0 m i n福 尔马林固定后 ， D N A产量减少到 3 0 。因此 ， 福尔 马林 固定会导致 D N A的降解 。酸性环境 中 D N A的 降解 已有 过深 入 的研究 。一般 认 为， 强酸 可导致 D N A的完全解
7、 聚， 而 弱酸也 能引起 一些结 构 的改 变。而骨组织 需经 福尔 马林 固定 、 1 0 硝 酸脱 钙 1 2 h 以上 ， 因此 D N A降解得更 多， 含量更少。用一 般的 D N A提取方法得到的 D N A质和量无法满足后 续实验 ， 从 石蜡 包埋组 织 中检测 结核 杆菌 的最 小 D N A量为 2 0 n g l ( 荧光定量 P C R检测结核杆菌试 剂盒要求 ) 。 Q I A G E N公司的 F F P E试剂盒是专门针对 石蜡 包埋组织 ， 它能打破碱基与组蛋 白之间的甲基交联 ， 经蛋白酶 K消化 ， 过柱纯化得到 D N A( 常规法 ) 。但 F F P
8、 E试剂盒提取穿刺和微小组织或脱钙组织 中的 D N A效果不佳。本实验采用常规 F F P E试剂盒提取 的脱 钙 骨 组 织 D N A 浓 度 非 常 低 ，为 ( 6 6 8 3 7 2 ) n g l ， 基本无法到达结核分枝杆菌核酸检测 试剂盒 ( Q I A G E N公 司) 要求检测 的最低 D N A浓度 ( 2 0 n g t x 1 ) 。而 我们 在 常规 F F P E试 剂 盒 中加 入 Q I A G E N公司微 量提取 物 D N A试剂 盒 中的 c a r r i e r R N A( 改 良法 ) ， 结果很大程度地提高了 D N A产量 ， 达到 (
9、 3 5 3 2 4 - 3 4 8 ) n g I x l ， 二 者有统计 学差异 ， 而 D N A纯度无显著差异。 两法提取的脱钙骨组织 D N A经荧光定量 P C R 检测结核杆菌发现， 常规法组检测结核杆菌的阳性 率 明显低于改 良法组。石蜡组织样品 P C R扩增成 功率低原因之一 ， 就是模板 D N A的质和量不够 ， 特 别对于硝酸脱钙后的骨组织 ， D N A遭 到严重破坏 降 解 ， 用常规方法提取 出来 的质量不达标 ， 会对后续检 测造成假 阴性结果。改 良法引入 的而是一种 R N A 载体 ， 特别是样品中 D N A含量极少的情况下 ， 它 能 增强 D N
10、 A与 Q I A a m p离心柱中膜的结合 ， 更大程度 上获得全部 D N A。但 由于额外添加 了 c a r r i e r R N A， 因此 ， 最 终得 到 的产 物 中可 能 含有 添 加 的 c a r r i e r R N A， 必须按照试剂盒 说 明按 A L缓 冲液与 c a r r i e r R N A比例为2 0 0 ： l 加人 。这样 即使含有额外加人 的 c a r r ie r R N A， 因为 R N A容易降解 ， 可以采取晾干时 间延长的方法降解而去除掉 c a r r i e r R N A， 得到纯度 较高的样品 D N A。 结核分枝杆菌
11、起始拷贝数的对数值与每个模板 的 c t 值呈 良好的线性关系 ， 也就 是说 ， 起始模板 D N A浓度越大， 荧光定量 P C R扩增的 c t 值越小， 有 效防止脱钙 骨组织 中结核分枝杆 菌荧 光定量 P C R 检测结果为临界值( 3 7 C t 4 4 0 ) ， 提高检测的敏感 性 ， 增加结果 的可判读性。本实验结果表明： 改 良法 提取的石蜡包埋脱钙骨组织 D N A质量显著提高 了 5倍 ， 荧光定量 P C R检测结核杆菌的阳性率从 1 5 提高到了5 5 ， 大大增加了阳性率， 提高了敏感性， 避免了由于 D N A质量过少造成的假阴性结果 ， 对病 理诊断提供 了
12、辅助作用。 该 D N A提取方法 的改 良和 D N A质量 的提高 ， 可用于微量 石蜡包埋组织 的几 乎所有基 因分 析技 术 ， 解决 了以往 由于提取的 D N A质量不够而无法进 行后续基因分析的问题。改 良法适用于穿刺标本和 微量石蜡包埋组织 D N A提取 ， 比如穿刺小细胞肺癌 标本进行 E G F R检测 ， 为临床靶 向治疗提供依据 ， 可 避免再次取材给患者带来 的痛苦。同时改 良法与常 规试剂盒提取法相比， 没有增加多余的实验步骤 ， 操 作简单 ， 也不浪费实验时间。因此 ， 该方法是一种值 得完善和推广的 D N A提取方法。 【 参考文献】 1 洪志强， 方梅，
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