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1、1MicroRNA155 通过下调清道夫受体表达抑制巨噬细胞泡沫化形成尚菲 曾德意 杨慧 黄琳燕 刘捷 吕晓飞 关永源 周家国【摘要 】 【目的】 探讨 microRNA-155(miR-155)对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制?【方法】 实时定量 PCR检测 miR-155的表达,Western Blot方法检测巨噬细胞 A类清道夫受体 SR-A和B型清道夫受体 CD36的表达,激光共聚焦显微镜观察 miR-155对THP-1结合 ?摄取 DiI标记氧化型低密度脂蛋白(DiI-oxLDL) 能力的影响?【结果】 80 g/mL的氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL) 时间依赖性地诱导巨噬细胞 m
2、iR-155表达上调?过表达 miR-155抑制 SR-A和 CD36的表达, 同时巨噬细胞结合?摄取 DiI-oxLDL的能力明显降低?而反义-miR-155 则明显上调 SR-A和 CD36的表达,同时巨噬细胞结合?摄取 DiI-oxLDL的能力明显增强?【 结论】 MiR-155通过降低巨噬细胞 SR-A和 CD36的表达抑制巨噬泡沫细胞的形成? 【关键词】 miR-155; 动脉粥样硬化; THP-1巨噬细胞; 清道夫受体; 泡沫化Abstract: 【Objective】 To study the effect of microRNA-155 (miR-155) on macroph
3、agic foam cell 2formation. 【Methods】 Real-time RT-PCR was used to test the expression of microRNA-155. Western blot was used to determine the expression of scavenger receptors SR-A and CD36 in THP-1 macrophages. Receptor-specific binding and uptake of DiI-labeled ox-LDL (DiI-oxLDL) were examined by
4、laser scanning confocal microscope. 【Results】 In THP-1 cells, 80 g/mL oxidized low density lipoprotein (ox-LDL) induced up-regulation of miR-155 in a time-dependent manner. Ad-miR-155 transfection decreased the expression of SR-A and D36, and the uptake and binding of THP-1 cell with DiI-oxLDL. In c
5、ontrast, miR-155 inhibitor increased the expression of SR-A and CD36, and the uptake and binding of THP-1 cell with DiI-oxLDL.【Conclusion】 MicroRNA-155 inhibits macrophagic foam cell formation through decreasing the expression of SR-A and CD36.Key words: microRNA-155; atherosclerosis; THP-1 cell; fo
6、am cell; Scavenger receptor表 1AuNP 和 EPI-AnNP的流体粒径(nm) 和 Zeta电位表阿霉素(epirubicin,EPI)为第二代蒽醌类抗肿瘤抗生素,在肿3瘤的治疗中占有重要地位,但是由于靶向性差限制了其进一步临床应用1,如何提高 EPI的靶向性已成为目前急需解决的问题? 近年来,纳米生物医学的发展为其提供了新的解决思路:将 EPI组装于纳米载体上, 组成纳米载药系统, 该系统既可以提高 EPI靶向性,又可以延长其体内滞留时间,从而提高药物疗效2?纳米金 (gold nanoparticles,AuNP)是直径介于 1 100 nm的金颗粒,具有生物
7、相容性好?组织渗透性强?表面易于修饰等优点3?有研究表明:AuNP本身具有抗肿瘤血管生成作用,其主要机制为 :AuNP可以结合血管内皮生长因子(VEGF165)的肝素结合位点,阻断其激活受体VEGFR2,进而抑制肿瘤血管内皮细胞的活化增殖4-5?另外,AuNP可以通过物理吸附?离子键结合?共价结合等方式结合抗肿瘤药物,组成 AuNP载药系统6? 该系统理论上既可以抗肿瘤血管生成,又可以抗肿瘤本身,发挥多靶点抗肿瘤作用?本实验中 ,课题组成功合成纳米金-表阿霉素载药系统(epirubicin-nanogold compounds, EPI-AuNP),体外观察其对人脐静脉内皮细胞 (human
8、umbilical vein endothelial cells, HUVEC)?人肝癌细胞 (HepG2)的增殖抑制作用,为将其进一步应用于体内多靶点抗肿瘤作用提供实验依据?1 材料与方法1.1 材 料4表阿霉素(EPI)为美国 Sigma公司产品 ,纳米金(AuNP)自行制备: 合成原料氯金酸? 柠檬酸钠均为分析纯, 购于国药集团化学试剂有限公司?RPMI-1640 培养液?L-谷氨酰胺?青霉素及链霉素均购于美国 Hyclone公司;M199 培养液?胎牛血清?胰蛋白酶为 Gibco公司产品,MTT (四甲基偶氮唑盐)及 DMSO(二甲基亚砜 )为美国 Sigma公司产品,实验用水为超纯水
9、?人肝癌细胞株 HepG2由本科室保存,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为原代分离培养? 动态激光散射仪(BI9000AT)为美国 Brookhaven公司产品;紫外-可见分光光度计(Lambda 45)为美国 PerkinElmer公司产品;透射电子显微镜(TECNAI 10)为 Philips公司产品;全波长多功能酶标仪(safire )为美国 Bio-Rad公司产品;相关酶标板为 Costar酶标板?1.2 AuNP的合成及鉴定我们采用氯金酸还原法,即利用柠檬酸将氯金酸中的 Au+3还原为 Au0?合成所用器皿均经过王水处理,5 mL柠檬酸钠(38.8 mmol/L)加入煮沸的 50 mL
10、氯金酸(1 mmol/L)溶液中, 用力搅拌过夜, 溶液变为葡萄酒色,AuNP 即合成?冷却至室温,用 0.22 m滤器过滤, 于 4 在玻璃瓶中保存备用; 利用透射电子显微镜(TEM) 和紫外-可见分光光度计(UV-Vis)对其进行鉴定?1.3 EPI-AuNP复合体的合成5取合成后的 AuNP溶液 4 mL,用超纯水稀释至 8 mL,用 1 mol/L NaOH溶液调 pH为 8.0(根据预实验结果),然后加入一定浓度的 EPI溶液 2 mL?置于恒温空气摇床(120 r/min) 37 过夜?然后20 000 r/min(r = 6.4)离心 40 min,弃去上清液,用 0.01mol
11、/L PB液冲洗 3次?重复离心 ?冲洗 3次后将制备的 EPI-AuNP重悬于 0.01 mol/L PB液中备用?1.4 EPI-AuNP复合体的鉴定取相同浓度 AuNP?EPI-AuNP溶液 : 动态激光散射仪(DLS)对其粒径变化进行检测;Zeta 电位仪检测其 Zeta电位变化;紫外-可见分光光度计(UV-Vis) 对其吸收光谱进行检测 ?另外,利用全波长多功能酶标仪(safire ) (激发波长 500 nm,发射波长 560 nm)对相同浓度 EPI?EPI-AuNP溶液的荧光强度进行检测?1.5 EPI-AuNP复合体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 的影响1.5.1HUVEC
12、 的分离培养取本医院产科健康产妇足月顺产或剖宫产的脐带,长度20 cm,无菌条件下用 PBS缓冲液洗净血迹, 将脐静脉两端夹闭后管腔内注入 2.5 g/L胰酶进行消化,10 min后收集脐静脉消化液,1 000 r/min(r = 16.1 cm)离心 10 min,轻轻6弃去上清液,将 HUVEC重悬于完全培养基(M199+100 mL/L胎牛血清),37 ?体积分数 5% CO2培养箱培养? 根据细胞生长情况,2 3 d换液 1次?传代至第 3代时进行以下实验?1.5.2MTT 比色法检测各组 HUVEC的生存率实验分为AuNP处理组?EPI 处理组?EPI-AuNP 处理组和空白对照组
13、,每组设6个复孔?HUVEC 以 5103个/ 孔接种于 96孔板,培养 24 h后各组分别加入 1 g/L AuNP?2 mg/L EPI?含 2 mg/L EPI的 EPI-AuNP溶液和无血清培养液 200 L,继续培养 24 h?实验终止前 4 h,每孔加入 0.5% MTT溶液 20 L?4 h后弃去上清液,加入 DMSO 150 L/孔?用多功能酶标仪( 测量波长 570 nm,参比波长 630 nm)测吸光度(A)值,细胞生存率(%) =(实验组 A值/对照组 A值)100%,以上实验重复 3次?1.5.3紫外-可见分光光度计(UV-Vis)检测 HUVEC内 EPI的积聚量实验
14、组分为 EPI处理组和 EPI-AuNP处理组,每组设 6个复孔?将 HUVEC以 1105个/ 孔种于 6孔板?培养 24 h后各组分别加入 EPI溶液 (10 mg/L)和 EPI-AuNP溶液( 含相同浓度 EPI) 1 mL?继续培养 2 h后将细胞用胰酶消化,移入 1.5 mL EP管中,离心(2 000 r/min,r = 15.9 min),0.1 mol/L PBS洗 3次后弃上清,1% Triton X-100(100 L)裂解细胞 ,UV-Vis测其 480nm处吸光度(A),根据 EPI浓度-吸光度标准曲线得出各组 HUVEC细胞内的 EPI积聚量?71.6 EPI-Au
15、NP复合体对 HepG2细胞的影响1.6.1HepG2 细胞的培养使用含 100 mL/L胎牛血清?青霉素 1105U/L?链霉素 100 mg/L的 RPMI-1640培养 HepG2细胞,2 d更换培养液 1次?待 HepG2细胞铺满培养瓶底的 80% 90%后,进行传代培养?1.6.2 MTT比色法检测各组 HepG2细胞的生存率实验分为 AuNP处理组?EPI 处理组?EPI-AuNP 处理组和空白对照组 ,每组设 6个复孔?HepG2 细胞以 5103个/ 孔接种于 96孔板,培养 24 h后分别加入 10 g/L AuNP溶液?20 mg/L EPI溶液? 含 20 mg/L EP
16、I的 EPI-AuNP溶液和无血清培养液 200 L,继续培养 24 h?MTT比色法检测各组 HepG2细胞的生存率?1.6.3UV-Vis 检测 HepG2细胞内 EPI的积聚量实验组分为 EPI处理组和 EPI- AuNP处理组,每组设 6个复孔? 将 HepG2细胞以 1105个/孔种于 6孔板?培养 24 h后各组分别加入 EPI溶液 (20 mg/L)和 EPI-AuNP溶液( 含相同浓度 EPI) 1 mL?继续培养 2 h后用胰酶消化细胞,移入 1.5 mL EP管中,离心(2 000 r/min,r = 15.9 cm 5 min),0.1 mol/L PBS洗 3次后弃上清 ,1% Triton X-100(100 L)裂解细胞,UV-Vis 检测各组 HepG2细胞内 EPI的积聚量?81.7 统计学分析采用 SPSS 13.0软件进行分析: 统计资料用 x s表示,
