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1、1CBIQ 对肺泡上皮细胞氧化损伤的保护作用作者：黄颖，张丙芳，招明高，王晓明，黄晨 【摘要 】 目的： 研究 CBIQ 对肺泡上皮细胞株 A549 氧化损伤的保护作用. 方法： 应用 MTT 法检测不同浓度 CBIQ 对正常及过氧化氢（H2O2）损伤的肺泡上皮细胞株 A549 的保护作用；DNA Ladder 检测细胞凋亡；相差显微镜观察 Hoechst 染色后细胞凋亡形态的变化. 结果： H2O2 损伤后的 A549 细胞经不同浓度 CBIQ处理后，细胞死亡数明显减少. 浓度为 110-2，110-3 mmol/L的 CBIQ 组平均细胞存活率分别为(76.10.8)%，(71.31.0)
2、%，较损伤组(46.30.9)%明显增高 (P0.01)；终浓度为 100 mol/L H2O2 及 10 mol/L CBIQ 共同干预 A549 细胞 4 h 后，可检测到凋亡标志性的 DNA 梯形带；实验组细胞凋亡率较对照组明显下降(P0.05). 结论： 在一定浓度范围内，CBIQ 对氧化损伤的 A549细胞生长有浓度依赖性的保护作用，并可抑制氧化损伤的 A549 细胞发生凋亡. 【关键词】 CBIQ；急性病；肺/损伤；肺泡；上皮细胞【Abstract】AIM: To explore the protective role of 24ChlorobenzoFisoquinoline (
3、CBIQ) in oxidatively damaged human lung epithelial cell line A549. METHODS: After cultured with different doses of CBIQ, the normal A549 cells and the oxidatively damaged cells were both tested by MTT assay. Cell apoptosis was detected by DNA Ladder. Cell morphological change was observed by Hoechst
4、 staining under a phase contrast microscope. RESULTS: After A549 cells were treated with different concentrations of CBIQ, dosedependent protection was demonstrated. The cell viability rate of the group by 110-2 and 110-3 mmol/L CBIQ were respectively (76.10.8)% and (71.31.0)%，which were higher mark
5、edly than the rate of the injury group (46.30.9)% (P0.01). Four hours after exposure to 100 molL H2O2 and 10 mol/L CBIQ, A549 cells undertook the apoptosis displayed by the DNA Ladder. The percentage of cell apoptosis was lower in experimental group than in control group (P0.05). CONCLUSION: In a ce
6、rtain concentration range, CBIQ can dosedependently protect human lung epithelial cells from oxidatively damage. The activator of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) can inhibit the apoptosis of oxidatively damaged A549 cells.3【Keywords】 CBIQ; acute disease; lung/injuries; pul
7、monary alveoli; epithelial cells0 引言急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是急性呼吸衰竭的重要病因之一. 氧化应激时产生的大量氧自由基和 H2O2 作用于肺部时可引起肺泡上皮细胞活性降低，甚至产生 ALI. 肺泡上皮细胞Na+， Cl-异常跨膜转运在肺水肿形成中起重要作用1. 囊性纤维跨膜电导调节因子(CFTR)是肺泡上皮细胞中一种氯通道蛋白，CFTR 异常可降低其对 Na+通道的抑制作用，致 Na+重吸收增加，加上 Cl-分泌减少，易导致肺组织水肿. CBIQ 是一种 CFTR 氯通道特异性开放剂2-3 ，能促进 CFTR 氯通道开放，使
8、 Na+向细胞内流动增加，提高肺泡的液体清除能力. 我们采用 A549 细胞作为肺泡上皮细胞模型，观察 CBIQ 对氧化应激引起 A549 细胞损伤的保护作用，探讨 CFTR 氯通道及 CBIQ 在 ALI 发生发展中的作用.1 材料和方法11 材料4人肺泡上皮细胞模型 A549 细胞由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室惠赠. CBIQ（Sigma 公司） ；噻唑蓝(MTT)（Sigma 公司） ；DNA Ladder 试剂盒、荧光染料 Hoechst 33258（上海碧云天公司） ；新生牛血清(杭州四季青) 1640 培养液(Gibco 公司).12 方法121 噻唑蓝(MTT)比色实验
9、测定细胞存活率用含 100 mL/L 热灭活新生牛血清的 1640 培养基培养 A549 细胞，置 37 ，50 mL/L CO2 及充分饱和湿度的培养箱内，隔日换培养液，直至细胞铺满瓶底的 70%80%，用胰蛋白酶消化并传代，选对数生长期A549 细胞以 2103 个/孔接种于 2 块 96 孔培养板，细胞贴壁培养24 h 后开始干预. 第 1 块板分 2 组. 对照组：只加培养液；实验组：分别加入不同浓度的 CBIQ（浓度分别为 110-1，110-2，110-3，110-4 ，110-5 mmol/L）. 反复试验 8 次. 第 2块板分 3 组：对照组：只加培养液；损伤组：加入 100
10、 mol/L H2O2；实验组：加入 100 mol/L H2O2 后再分别加入不同浓度的 CBIQ（浓度分别为 110-1，110-2，110-3，110-4，110-5 mmol/L）. 反复试验 15 次. 干预后共孵育 24 h 进行MTT 实验，每组设 5 个复孔. 与实验组平行设只加培养液不加细胞5的空白对照孔，比色时以此孔调零. 酶联免疫检测仪测定不同药物浓度的 A490 nm. 以每组 5 个孔 A490 nm 的平均值作为各组的平均 A490 nm 值. 记录结果，取数次结果的平均值，计算各组细胞的存活率：细胞存活率=(实验组 A490 nm 对照组 A490 nm)100.
11、122DNA 梯形带法检测细胞凋亡实验共分 3 组. 对照组：正常细胞；损伤组：加入 100 mol/L H2O2；实验组：加入 100 mol/L H2O2 后再加入 110-5 mol/L 的 CBIQ. 细胞经干预后收获约 1106 个细胞，PBS 洗涤 2 次，加含 2.5 L 蛋白酶 K 的裂解液 500 L 裂解细胞， 50水浴过夜；采用苯酚 氯仿抽提法，4高速离心提取 DNA，加 60 L 醋酸胺和 600 L 冷无水乙醇-20过夜；4高速离心 10 min， 700 mL/L 冷乙醇 700 L 漂洗沉淀，TE 缓冲液 60 L 溶解 DNA. 取 5 L DNA 溶液进行 1
12、8 g/L 琼脂糖凝胶电泳，将电泳凝胶置于 Gel Doe 2000 凝胶图像扫描分析系统，扫描图像.123Hoechst33258 荧光染色观察细胞凋亡率实验共分3 组. 对照组：正常细胞；损伤组：加入 100 mol/L H2O2；实验组：加入 100 mol/L H2O2 后，再加入 110-5 mol/L CBIQ. 细胞干预前于 6 孔板中铺板爬片，每孔约 5104 个细胞. 干预 6 h 后将玻片取出，40 g/L 多聚甲醛固定 10 min，PBS 洗涤，Hoechst6染色 5 min，置于荧光显微镜下观察细胞形态及细胞核的变化. 对每张细胞片随机选取 5 个高倍视野，分别计数
13、正常细胞数 (胞膜完整，着均匀蓝色)，凋亡细胞数( 核染亮蓝色，呈均匀的致密斑块或分叶状)，每个样品至少计数 100 个细胞，镜下计数细胞凋亡率. 取 5 次结果的平均值.统计学处理：实验数据均以 xs 表示，采用统计软件 SPSS 120 进行 ANOVA 方差分析. P0.05 为差别有统计学意义.2 结果21 细胞存活率浓度为 110-1，110-2，110-3，110-4，110-5 mmol/L CBIQ 实验组细胞平均存活率分别为(71.63.9)%，(98.71.8)%，(99.21.6)%，(97.62.3)%，(97.92.4)%. 其中浓度为 110-1 mmol/L 组与
14、对照组（100%）比较差异有统计学意义（ P0.05）. H2O2 损伤组细胞存活率为(46.30.9)% ；浓度为 110-1，110-2，110-3，110-4，110-5 mmol/L 的 CBIQ 实验组平均细胞存活率分别为(63.80.9)%，(76.10.8)%，(71.31.0)%，(63.90.9)%，(62.31.0)%. 其中浓度为 110-2，110-3 mmol/L 组与损伤组比较差异有统计学意义（P0.01 ）.22 凋亡的检测 DNA 梯形带检测结果显示 A549 细胞染色7质 DNA 裂解成 180200 bp 和其不同倍数的片段，琼脂糖凝胶电泳后显示出凋亡细胞特
15、有的梯形带（图 1） .23 凋亡率的测定 H2O2 损伤组凋亡率为(47.32.7)%，镜下可见细胞凋亡数明显增多，且多为分叶状（图 2）. CBIQ 实验组为(28.53.9)%，较损伤组细胞凋亡数明显减少，且多为致密斑块，两组差异有统计学意义（P0.05 ）.3 讨论渗透性肺水肿尤其是肺泡内水肿是导致 ALI 时低氧血症的主要病理基础之一4 . 肺泡上皮细胞作为 ALI 主要受损的靶细胞，具有保持肺泡相对干燥的屏障功能. 在致伤因素作用下，肺泡上皮细胞损伤，导致液体漏入肺泡腔；肺泡上皮液体转运机能受损，肺泡内液体清除障碍，造成肺泡性肺水肿5.CFTR 氯通道是肺泡上皮细胞中起最主要作用的
16、一种氯离子通道. Su 等6发现 CFTR 氯通道和质子门控钠通道共同存在于人呼吸道黏膜腺细胞和呼吸道上皮细胞，在损伤肺组织的水盐转运中共同起调节作用. 对鼻腔黏膜上皮细胞及中耳上皮细胞均有类似研究，CFTR 氯通道可抑制 Na+重吸收，在鼻炎及中耳炎的液体分泌中有重要意义7-8 . 但在肺泡上皮细胞水平的研究较少. Gu 等89 通过在体实验观察到使用 CFTR 开放剂 NS004 可增加肺泡液体清除率，提示可能与 Na+转运有关. Szkotak 等3在正常呼吸道上皮细胞中发现 CBIQ 可通过同时开放细胞顶膜的 CFTR 氯通道和基底侧膜的 Ca2+敏感 K+通道从而增加 C1-和 K+分泌. 理论上，可进一步通过质子泵的作用使 Na+重吸收减弱，水排
