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1、1CD59 位点短肽封条对 HeLa 细胞凋亡相关基因caspase3 和 survivin 作用作者：李先平 高美华 石学香 张蓓 程颖 【摘要 】 目的 检测 CD59 位点短肽封条对 HeLa 细胞凋亡相关基因 caspase3、survivin 表达水平的影响，探讨 CD59 位点短肽封条促肿瘤细胞凋亡的可能机制。方法 将 CD59 位点短肽封条作用于 HeLa 细胞，利用免疫组织化学方法检测短肽封条作用 12 h 和 24 h 后 HeLa 细胞 caspase3、survivin 的表达水平。结果 caspase3 表达随短肽封条剂量和作用时间的增加而增加；survivin 表达随
2、短肽封条的剂量和作用时间的增加而减少。结论 CD59 位点短肽封条能下调 survivin 的表达并活化 caspase3，从而可能导致 HeLa 细胞的凋亡。 【关键词】 抗原 CD59 短肽封条 survivin caspase 3 免疫组织化学 ABSTRACT Objective To study the effect of peptide seals on CD59 to HeLa cells, detect expression of apoptosisrelated gene survivin, caspase3 in HeLa cell and investigate the
3、mechanism of peptide seals to CD59 in inducing apoptosis of HeLa cells.Methods The peptide seals 2to CD59 were put into HeLa cells. Expressions of caspase3 and survivin were detected by immunohistochemistry after interaction with peptide seals for 12 and 24 hours, respectively. Results Expression of
4、 caspase3 increased, while survivin decreased with increase of dosage of the peptide seals and prolongation of action time. Conclusion The peptide seal to CD59 can downregulate the expression of survivin, activate caspase3 and play a great role in enhancing the apoptosis of HeLa cells. KEY WORDS Ant
5、igens, CD59; Peptide seal; Survivin; Caspase3; Immunohistochemistry CD59 是一种以糖基磷脂酰肌醇（GPI ）锚着于细胞膜表面的具有抑制补体效应功能的糖蛋白。它可以通过与 C8 或 C9 的竞争性结合而抑制攻膜复合体 MAC 在细胞膜的形成，是宿主细胞免受活化的补体攻击的最重要的补体调节蛋白。全球医学界始终致力于寻找特异性作用于肿瘤组织或细胞的抗瘤药物。以单克隆抗体为主要载体的“生物导弹”以其特异性高、毒性小等优点，曾被寄予很大的希望。但是由于肿瘤免疫逃逸的问题，使得单克隆抗体的临床应用受到很大限制。研究发现，CD59 与肿
6、瘤的生长失控及转移密切相关1。由于在很多实体瘤细胞膜表面存在或者高表达 CD59 等一3系列的膜补体调节蛋白,使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单克隆抗体治疗中由补体介导的溶细胞作用2,3,免疫逃逸是导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因。目前，在实体肿瘤的免疫治疗中，一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达。国内外学者研究证实， CD59 分子中 N37H44 位氨基酸与人类糖尿病血管增殖症的发生密切相关4,5，但与肿瘤细胞逃逸信号密切相关 CD59 活性位点的研究国内外鲜有报道。本课题组利用噬菌体肽库筛选技术体外合成了可阻断与肿瘤逃逸相关的CD59 活性位点的短肽封条
7、6。本研究采用该短肽封条作用于HeLa 细胞，观察其对 HeLa 细胞的封闭作用，并探讨其诱导 HeLa细胞凋亡的可能机制。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 1 000 mg/L 的 CD59 位点的短肽封条由本课题组设计，送北京中科亚光生物科技有限公司合成；HeLa 细胞由本实验室保存；caspase3、survivin 免疫组化试剂购于武汉博士德公司。 1.2 方法 1.2.1 CD59 位点的短肽封条的设计与合成 本课题组利用噬菌体显示技术和生物信息技术从噬菌体随机 12 肽库中对转染人CD59 的 CHO 细胞和转染突变人 CD59 的 HeLa 细胞进行全细胞筛选,
8、经过 5 轮亲和富集筛选后，得到 3 条高度同源的多肽序列：4HSACDLLMHPMC， HSACDLPMHPMC，HSACDLPKAPWC，运用 DNA STAR 软件进行分析， 3 种序列与已公布的 CD59 的天然配体 CD2（PubMed: 339HGAAENSLSPSS）都含有HAP一级结构。而且，HGAAENSLSPSS 含有 10 个疏水性氨基酸，与获得的含有 9 个疏水性氨基酸的 3 种序列比较接近。测序后的碱基序列转换为氨基酸序列，并将一致性的短肽序列提交 PIR 国际蛋白质数据库进行查询比对，进行同源性分析，未发现有同源性一致的序列。将同源性高的序列送北京中科亚光生物科技有
9、限公司进行短肽合成。 1.2.2 细胞培养 在含有体积分数 0.008 胎牛血清、100 mg/L 青霉素及链霉素的 RPMI 1640 培养液中，于 37 体积分数0.05 CO2 培养箱中培养细胞, 每 48 h 换液传代 1 次, 取生长良好的细胞进行实验。 1.2.3 caspase3、survivin 免疫组织化学染色 采用培养的对数生长期的细胞，以每孔 105 个细胞接种于 24 孔培养板（每孔铺有一小块盖玻片）,每孔加 1 mL 的 RPMI 1640 完全培养液。实验设立 HeLa 细胞对照组（组） ；HeLa 细胞+10 mg/L CD59 位点的短肽封条作用 12 h 组（
10、组） ；HeLa 细胞+10 mg/L CD59 位点的短肽封条作用 24 h 组（组） ；HeLa 细胞加 50 mg/L CD59位点的短肽封条作用 12 h 组（组） ； HeLa 细胞加 50 mg/L CD59 位点的短肽封条作用 24 h 组（组） 。培养 48 h 后，组取出 3 张盖玻片用 40 g/L 的多聚甲醛固定。给予细胞换液，组仍然5每孔加 RPMI 1640 的完全培养液 1 mL；组和组每孔加入 1 mL 含有 10 mg/L CD59 位点短肽封条的 RPMI 1640 完全培养液；组和组每孔加入 1 mL 含有 50 mg/L CD59 位点短肽封条的RPMI
11、1640 完全培养液。培养 12 h，组、组和组每组各取出 3 张盖玻片，用 40 g/L 的多聚甲醛固定。其余的细胞继续培养12 h 后，组、组和组每组各取出 3 张盖玻片，用 40 g/L 的多聚甲醛固定 0.5 h 后，取出全部的盖玻片进行免疫组织化学染色。免疫组织化学的染色步骤按照试剂盒说明书操作。采用 HPIAS 22000 高清晰度彩色病理图文报告管理系统对 caspase3 和survivin 的表达进行定量分析,每张爬片随机选取 5 个完整而不重叠的高倍镜视野(400 倍),测定每个视野下阳性反应的平均吸光度。以每例 5 个视野的平均吸光度作为该例的测量值。 1.2.4 统计学
12、分析 应用 SPSS 10.0 软件进行统计学处理，组间比较采用 t 检验。 2 结果 2.1 细胞免疫组织化学染色 caspase3、survivin 阳性染色主要定位于细胞质，也可见细胞核着色。 2.2 各组 caspase3、survivin 表达的比较 组、组与对照组比较，组、组分别与组、组比6较，组与组比较，组与组比较，caspase3 的表达量显著升高（t=4.2614.07,P0.01） ；组、组与对照组比较，组、组分别与组、组比较，组与组比较，组与组比较, survivin 的表达量降低（t=3.01 10.29,P0.05、0.01） 。见表 1、2。 表 1 各组 HeLa
13、 细胞 caspase3 表达的平均吸光度值比较（略） 表 2 各组 HeLa 细胞 survivin 表达的平均吸光度值比较（略）3 讨论 国内外报道，在多种实体肿瘤细胞中如肠道、卵巢、前列腺等发现有 CD59 分子的过表达，并发现 CD59 分子与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。因此，CD59 分子已逐渐成为研究肿瘤细胞逃逸自身免疫监视及肿瘤免疫导向治疗中新的靶点和热点。但作为与肿瘤逃逸信号密切相关的 CD59 活性位点的研究国内外未见相关报道。本课题组已经利用噬菌体显示技术和生物信息技术从噬菌体随机 12 肽库中对转染人 CD59 的 CHO 细胞进行全细胞筛选,经过 5 轮亲和富集
14、筛选后，设计并体外合成了与人 CD59 分子特异结合的短肽封条7。 caspase3 是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶。7caspase3 活化主要有两条途径：一是经细胞表面膜受体如 Fas、肿瘤坏死因子 1 型受体相关蛋白 (TNFR1)等活化；另一途径是在死亡刺激因子作用下,线粒体释放细胞色素 C8。体外实验证实，caspase3 活化的两条途径都可被 survivin 抑制。survivin 可直接作用于 caspase3 和 caspase7：一方面可以与有活性的caspase3 和 caspase7 特异性结合, 当 caspase3 与survivin 结合后,即在细胞内失活
15、；另一方面 survivin 也能阻止caspase3 和 caspase7 的自发激活,从而抑制细胞的凋亡。survivin 基因是近几年分离鉴定的，是目前所发现的最强的凋亡抑制基因9。survivin 编码产生含 142 个氨基酸的蛋白 ,主要通过抑制caspase3、caspase7 蛋白酶活性而抑制细胞凋亡10,11。其过量表达可能导致肿瘤细胞逃避细胞周期检测点,从而使肿瘤细胞逃避凋亡, 实现异常增殖, 导致肿瘤的形成。本研究结果显示，CD59 特异位点的短肽封条作用于 HeLa 细胞后，随着作用时间和短肽剂量的增加，caspase3 的表达量逐渐增加，survivin 的表达量逐渐减
16、少。由此证明特异性的短肽封条与 HeLa 细胞膜上的 CD59 结合后，能促进 caspase3 的表达，抑制 survivin 的表达。说明 CD59 特异位点短肽封条可能有促进 HeLa 细胞凋亡的作用。 有文献报道，CD59 与特异的单克隆抗体交联以后，能产生钙离子流，使胞浆内的钙离子浓度升高12。钙离子浓度升高以后，线粒体摄取钙离子,线粒体钙超载导致线粒体损伤, 细胞色素 C 释放, 活化 caspases, 诱导细胞凋亡 13。我们的短肽封条的一级结构和8CD59 的天然配体 CD2 有部分同源序列，上述机制可能在引起细胞的凋亡过程中起一定的作用。另外，我们也观察到ACDLLM 短肽存在于 TNFR1 中，而我们合成的短肽中也含有ACDLLM 短肽序列。据 MONL
