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1、1CD147 分子与 MMPs 在肝癌细胞系中表达的相关性作者：王贤辉陈志南郭晓楠 【关键词】 CD147 关键词: CD147;基质金属蛋白酶; 肝癌细胞 摘 要: 目的 研究 CD147 与 MMPs（基质金属蛋白酶）在肝癌细胞系中表达的相关性. 方法 流式细胞仪检测正常肝细胞 QZG及不同肝癌细胞系（BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721，HHCC 和 HHCC-9204）中 CD147 的表达;酶谱法分析其产生 MMPs 的含量及活性. 结果 正常肝细胞株 QZG 中 CD147 表达阴性，其余 5 株肝癌细胞系 CD147 表达阳性 ;MMP-2 和 MMP-9在 Q
2、ZG 和肝癌细胞系中均表达，但在肝癌细胞系中表达明显增高;MMP-9 以酶原和活性形式表达，MMP-2 仅以酶原形式表达;统计学分析 CD147 与 MMPs 表达成正相关. 结论 CD147 可作为判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的标志. Keywords:CD147;MMPs;hepatoma cells Abstract:AIM To study the relation between CD147and the expression of MMPs in hepatoma cell lines.METHODS 2Expression of CD147in human liver cell
3、 QZG and different hepatoma cell lines（BEL-7402，QGY-7404 ，SMMC-7721，HHCC ，HHCC-9204）was investigated by flow cytometer.Zymograph was used to study the content and types of posi-tive MMPs.RESULTS CD147was positively presented in five hepatoma cell lines，but in normal liver cell was nega-tive.MMP-2and
4、 MMP-9were detected by all the hepatoma cell lines and normal liver cell but the expression in hepatomacell lines was obviously high.The relation between CD147molecule and the expression of MMPs was a positive one.CONCLUSION CD147could be used as a marker to judge the invasion and metastasis of hepa
5、tocellular carcinoma. 0 引言 大量研究显示 MMPs（基质金属蛋白酶）与多种肿瘤的侵袭转移有关1 ，其中 IV 型胶原酶（MMP-2 明胶酶 A 和 MMP-9明胶酶 B）通过降解基底膜 IV 型胶原在恶性肿瘤早期的侵袭中起重要作用2，3 .CD147 是新的细胞表面粘附分子，介导细胞间的粘附，具有 TCSF/EMMPrin（肿瘤细胞起源的胶原酶刺激因子/细胞外基质金属蛋白酶诱导因子）的作用，而有助于癌细胞的侵袭转3移4，5 .然而 CD147 在肝癌细胞表面的表达，以及肝癌细胞产生 MMPs 的形式及活性，尤其是两者的相关性研究未见报道.我们利用酶谱法（zymogra
6、ph）及流式细胞仪对 MMPs 和 CD147 在肝细胞及肝癌细胞的表达进行研究，以揭示 CD147 与 MMPs 的相关性，并探讨以 CD147 为标志判断肝癌细胞具备高侵袭转移潜能的可能性. 1 材料和方法 1.1 材料 抗 CD147mAb 为美国 pharMingen 公司产品，FITC-羊抗鼠 IgG 购自华美生物工程公司， ELITE ESP 型流式细胞仪为美国库尔特公司产品，正常人肝细胞系 QZG，人肝癌细胞株BEL-7402，QGY-7404，SMMC-7721 和人肝癌细胞系 HHCC 均来自中科院上海细胞所细胞库，HHCC-9204 由本室建立，培养用含有 100mLL-1
7、 小牛血清的 RPMI1640 培养基. 1.2 方法 1.2.1 FCM 定量检测 CD147mAb 的结合率 收集对数生长期的细胞制备高活性单细胞悬液至浓度（5 10）109 L-1 ，正常马血清封闭非特异位点加饱和CD147mAb5mgL-1 4静置 30min，DPBS 离心洗涤2 次加 FITC-IgG 孵育 30min，4 ，离心洗涤后固定液固定，待测.4同时设无关 mAb 抗乙脑病毒 IgG 为阴性对照. 1.2.2 细胞培养及细胞上清收集沉淀 上述 6 株细胞采用RPMI1640 完全培养基培养，置于 37含 50mLL-1 CO2 培养箱内，待细胞长满培养瓶（ 100mm15
8、mm） ，用无血清RPMI1640 培养液洗涤 3 次后加含 20mLL-1 胎牛血清RPMI1640 培养 3d，收集上清，梯度离心800g，15min，15000g，30min ，上清用 800gL-1 饱和硫酸铵沉淀，4， 8h，15000g，30min 收集沉淀用10mmolL-1 Tris-HCL，pH7.5 透析除盐. 1.2.3 明胶酶谱法6 透析后的蛋白样品进行 SDS-PAGE电泳，其中分离胶含 1gL-1 的明胶.电泳结束后将凝胶置于洗脱液（25mLL-1 Tristion X-100， 50mmolL-1 Tris-HCl，pH7.5 ，0.1molL-1 NaCl）室温
9、洗 2 次，45min/次，接着将凝胶置于孵育液（50mmolL-1 Tris-HCl，pH7.5 ，10mmolL-1 CaCl2 ，0.2gL-1 NaN3 ）37 孵育 24h 以上，考马斯亮蓝染色，脱色液脱色，蓝色背景上出现 MMPs 透亮带.经图像分析系统读取条带面积和酶解条带灰度，酶含量=条带面积（条带灰度背景灰度）. 5统计学处理: 结果以 x s 表示，分析线性相关性，检验相关系数. 2 结果 2.1 FCM 测定 CD147mAb 标记细胞阳性率及平均荧光强度 CD147 分子在不同肝癌细胞系中均表达阳性，以阴性对照荧光强度12.610.4 为参照，CD147 分子在 HHC
10、C 中表达强阳性，在SMMC-7721 中表达弱阳性，在正常肝细胞 QZG 中表达阴性（Tab1）. 表 1 CD147 在不同细胞系中的阳性率及平均荧光强度略 2.2 不同细胞系的明胶酶谱和 MMPs 酶含量的测定 不同细胞系的明胶酶谱显示在蓝色背景的 3 条透亮条带， A 带为 MMP-9酶原形式，分子质量 92ku;B 带为激活的 MMP-9，分子质量86ku;C 带为分子质量 72ku 酶原形式的 MMP-2（Fig1）.经图像分析系统测定各明胶酶的含量（Tab2 ）. 图 1 略 表 2 MMPs 在不同细胞系中的含量略 62.3 CD147 荧光强度与 MMPs9 含量的相关性 经
11、过统计学分析肝癌细胞与正常肝细胞 QZG，CD147mAb 平均荧光强度有明显差异（P0.05） ，而其 MMPs 酶总量的分泌之间也具有明显差异（P0.01）.6 株细胞系 CD147mAb 平均荧光强度 X 与其MMPs 总量 Y 之间经相关性检验相关系数 r=0.9183，P0.01.线性回归方程为 Y=80370.4+2030.8X. 3 讨论 CD147 分子属 IgSF 中高度糖基化的单次跨膜糖蛋白，主要参与细胞-细胞或细胞- 基质的粘附.曾有实验表明表达于肺癌细胞系LX-1 表面的该分子可刺激人成纤维细胞分泌 MMPs 而有助于癌细胞的浸润扩散7 .另有文献8 ，9报道肿瘤细胞表
12、达的CD147 分子可作用于邻近的癌细胞，相互诱导促进 MMPs 释放降解基质，并水解肿瘤细胞表面的粘附成分而有助于癌细胞的迁移.因此，CD147 分子在肿瘤细胞的侵袭转移中起重要作用.我们的实验发现 CD147 分子在肝癌细胞系与正常肝细胞表面的表达呈现显著差异. 另外，IV 型胶原酶 MMPs-2 和 MMPs-9 的分泌及活性形式在两者之间亦有明显不同，在肝癌细胞中明显高于正常肝细胞.尤其以MMP-9 的含量增高为主10 .据文献 11，12 报道，在恶性度高的肿瘤组织中 MMP-9 的表达上调而且其含量随癌细胞转移率的增高而增加，并以 103ku，92ku 的酶原形式及 86ku 的活
13、化形式7表达，表明 MMP-9 与肿瘤细胞的关系更为密切.我们的实验证实CD147 分子表达于多株肝癌细胞表面，而正常肝细胞为阴性表达，同时检测了其培养上清中与恶性肿瘤转移密切相关的 IV 型胶原酶MMP-2 和 MMP-9 的表达及活性形式 .CD147 分子的表达的确与MMPs 的含量呈正相关，表明肿瘤细胞表面的 CD147 分子可刺激和激活自身 MMPs 的释放而促进癌细胞的侵袭转移，因此 CD147分子可作为肝癌细胞侵袭转移的间接标志. 参考文献: 1Hideaki N，Frederick W.Mtrik metalloproteinases J.J Biol Chem，1999;27
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16、 Dermatol，1996;106:1260-1265. 6Thomas M，Leber ，Frances R.Balkwill.Zymography:A sin-gle-step staining method for quantitation of proteolytic activity on substrate gels J.Anal Biochem，1997;249:24-28. 7Guo HM，Zucker S，Gordon MK.Stimulation of matrix metal-loproteinase production by recombinant extracellular matrix metalloproteinase inducer from transfected chinese hamster o-vary c
