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1、1Caspase3、Bcl-2 蛋白在胎盘组织中的表达及其与羊水过少的相关性研究作者：高丽萍，孙丽洲，隋灿烂，贾政伟，缪玉梅，吕爱远 【摘要 】 目的 探讨胎盘组织中凋亡蛋白 Caspase3、凋亡抑制蛋白 Bcl-2 的表达及其与羊水过少的相关性。方法 采用免疫组化法检测羊水过少 30 例（羊水过少组）和正常产妇 30 例(对照组)胎盘滋养细胞 Caspase3、Bcl-2 的表达，通过免疫组化积分判断两者表达的高低。结果 羊水过少组胎盘滋养细胞 Caspase3、Bcl-2 表达的免疫组化积分分别为 4.900.71、1.800.76，对照组分别为2.060.64、4.000.69。羊水过
2、少组 Caspase3 的表达明显高于对照组(P0.05)，而 Bcl-2 则明显低于对照组(P0.05)。Caspase3 与 Bcl-2 在羊水过少组胎盘滋养细胞中的表达呈负相关(r=-0.74， P0.05)。结论 胎盘滋养细胞 Caspase3 高表达、Bcl-2 低表达可能与羊水过少的发生有关。Caspase3 与 Bcl-2 在胎盘滋养细胞中的表达失衡可能是羊水过少发生的原因之一。 【关键词】 Caspase3；Bcl-2；羊水过少；胎盘；免疫组织化学 Abstract: Objective To explore the relationship between the expre
3、ssions of caspase3 and Bcl-2 in placenta and the event of oligohydramnios Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of caspase3 and 2Bcl-2 in placenta from a test group (30 cases of oligohydramnios) and a control group (30 cases of normal pregnancy) Results Immunohistoc
4、hemistry showed the expression of caspase3 in placental trophoblasts was higher in the test group than in the control (4.900.71 vs. 2.060.64, P0.05）, and the expression of Bcl-2 was lower in the test group (1.800.76 vs. 4.000.69, P0.05). The expression of caspase3 was inversely correlated with that
5、of Bcl-2 in oligohydramnios (r=-0.47，P0.05) Conclusion The expressions of caspase3 and Bcl-2 in placenta may play important roles in oligohydramnios. The imbalance of their expressions may be one of the causes of oligohydramnios Key words: caspase3；Bcl-2；oligohydramnios；placenta；Immunohistochemistry
6、 羊水过少是一种常见的妊娠并发症,其发生会增加围生儿的不良预后和剖宫产率。羊水过少的原因与胎盘功能异常有很大的关系1 ，孕晚期胎盘存在细胞凋亡，而一些凋亡因子（如Caspase3、Bcl-2 等）与羊水过少密切相关。本文通过检测羊水正常和羊水过少产妇胎盘组织中 Caspase3 和 Bcl-2 的表达情况，探讨两者在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达及其相关性。 1 对象和方法 1.1 对象 选择 2006 年 7 月 2008 年 6 月在我院足月分娩的产3妇共 60 例，其中羊水过少（羊水过少组） 30 例，正常妊娠(对照组)30 例，各组产妇年龄及孕周比较，差异无显著性。各组产妇均为单胎，所有
7、病例均排除内科合并症及其他产科并发症(前置胎盘、胎盘早剥、母儿血型不合、妊娠高血压疾病、胎膜早破、胎儿生长受限等，且排除胎儿畸形)。羊水过少的诊断标准参照妇产科学 1 。1.2 标本采集及处理 1.2.1 胎盘采集 胎盘娩出后立即在母体面中部剪取组织 1 块，大小 1.5 cml.5 cm1.0 cm。然后用生理盐水漂洗干净，中性甲醛固定 24 h，浸蜡，石蜡包埋，4 m 连续切片。 1.2.2 Caspase3、Bcl-2 免疫组化染色 采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)连接法。用二氨基联苯胺 (DAB)显色试剂盒显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。实验步骤严格
8、按照操作方法说明进行，空白对照采用磷酸盐缓冲溶液代替一抗。 1.3 结果判定标准 采用免疫组化评分(H-score)法2 。由 2 名观察者对切片进行盲式阅片，显微镜下随机选择 5 个高倍镜视野(400)，观察所选择视野中的所有细胞，记录阳性染色细胞百分数并计分。阴性：小于 5的胎盘合体滋养细胞呈阳性或滋养细胞显色与背景一致，计 0 分；弱阳性： 510 的胎盘滋养细胞呈阳性，计 1 分；阳性：1150的胎盘滋养细胞呈阳性，计 2 分；强阳性：大于 50的胎盘滋养细胞呈阳性，计 3 分。细胞着色强度4则以多数阳性细胞呈现的染色(棕黄色) 计分。强着色，计 3 分；浅着色，计 1 分；染色强度在
9、浅着色和强着色之间者为中等着色，计2 分。将阳性细胞百分数计分和细胞染色计分相加为免疫组化积分。1.4 统计学处理 采用 SPSS 11.5 统计软件进行统计分析。实验结果以 xs 表示，组间比较采用 t 检验，采用 Spearman 分析Caspase3 与 Bcl-2 的相关性。 2 结 果 2.1 Caspase3、Bcl-2 在胎盘组织中的表达定位 Caspase3、Bcl-2 主要表达在胎盘滋养细胞和胎盘合体滋养细胞中，羊膜中呈阴性或弱阳性。Caspase3 与 Bcl-2 蛋白阳性表达呈棕黄色，颗粒状，阳性信号主要定位于胎盘合体滋养细胞的胞质中。见图 1。 图 1 Caspase3
10、、Bcl-2 在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达 A.羊水过少胎盘滋养细胞 Caspase3 染色阳性（ SP，400 ） ；B.羊水过少胎盘滋养细胞 Bcl-2 染色阴性（SP，400） 2.2 Caspase3、Bcl-2 在胎盘组织中的表达比较 羊水过少组胎盘滋养细胞中 Caspase3 表达水平高于对照组，Bcl-2 表达水平低于对照组，差异有显著性(P0.05)，见表 1。表 1 胎盘滋养细胞Caspase3、Bcl-2 表达的免疫组化积分 2.3 Caspase3、Bcl-2 在胎盘组织中的表达关系 羊水过少组胎盘滋养细胞中 caspase3 与 Bcl-2 的表达水平呈负相关(r=-
11、50.74，P0.05)。 3 讨 论 3.1 Caspase3、Bcl-2 的生物学特性 Caspase 是一组半胱天冬蛋白酶家族，其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用。Caspase3是已知的该家族成员中执行细胞凋亡的关键酶之一，它广泛分布于各种类型的细胞中，在细胞内以无活性的前体（酶原）形式存在，被细胞外凋亡信号激活后，使胞质、胞核及细胞骨架的重要蛋白酶失活，引发细胞凋亡。作为一种效应 Caspase，Caspase3 是细胞凋亡途径末端底物酶解的关键效应蛋白酶3 ，是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，也为凋亡的关键酶和执行者，其表达意味着细胞死亡。 Bcl-2 是抑制细胞凋亡的线粒体膜
12、蛋白，其 C 末端含有一个 19 个氨基酸组成的疏水跨膜区，其功能是作为一个信号锚定序列，负责定位和插入到线粒体外膜，抑制细胞凋亡，是迄今研究的最深入、最广泛的凋亡调控基因之一。Bcl-2 可对抗细胞自我产生的氧自由基及细胞外产生的氧自由基(邻近细胞产生) 对细胞的毒害与损伤作用，可以抑制或防止多种因素或因子诱发的细胞凋亡，延长细胞的寿命，是许多生理或病理凋亡的关键性调节因子，对细胞凋亡具有直接调节作用。 3.2 Caspase3、Bcl-2 在羊水过少胎盘滋养细胞中的表达 Caspase3、Bcl-2 在细胞凋亡过程中发挥了十分重要的作用，但二者的影响不同。本实验研究中发现，Caspase3
13、、Bcl-2 在羊水过少6胎盘滋养细胞中的表达呈负相关，即细胞中 Caspase3 蛋白表达增加，而 Bcl-2 蛋白表达下降。这种现象的发生可能是由于 Bcl-2 蛋白可以阻断细胞色素 C 从线粒体释放，从而抑制 Caspase3 的激活。Caspase3、Bcl-2 蛋白具体是通过怎样的途径来相互影响还有待进一步深入研究。 3.3 Caspase3、Bcl-2 与羊水过少发生的关系 妊娠是一个复杂的生理过程，正常妊娠胎盘细胞凋亡是一种生理现象，作为组织更新的一种方式一直伴随着胎盘发育全过程。有研究全面观察胎盘中的凋亡细胞，发现 50 %以上的凋亡细胞为滋养细胞4 。滋养细胞的凋亡使细胞体积
14、缩小，滋养细胞表面的水通道蛋白失活，不再介导水分子的跨膜运动，导致细胞对水分子的通透性明显下降5 ，从而引起妊娠羊水过少的发生。 正常妊娠胎盘绒毛滋养细胞均有 Caspase3 的表达，它与细胞凋亡紧密相关，对维持母胎之间的交换及胎儿的发育有着极其重要的意义。凋亡抑制蛋白 Bcl-2 则在抑制滋养细胞凋亡中起保护作用，近期研究证实低表达 Bcl-2 可致滋养细胞凋亡降低6 。Caspase3和 Bcl-2 在子宫与胎盘界面的表达异常可导致母胎间营养物质交换发生紊乱，出现水通道异常，胎盘发生病理改变及继发性影响胎儿的生存环境羊水的变化，从而导致病理妊娠的发生。本研究发现光镜下 Caspase3
15、在羊水过少组胎盘滋养细胞的表达以中度及强阳性为主，明显高于正常妊娠组，差异有显著性(P0.05)，羊水过少组胎盘滋养细胞 Bcl-2 的表达明显低于正常妊娠组（P0.05） 。7我们推测：羊水过少患者胎盘滋养细胞高表达 Caspase3 和低表达Bcl-2 可能在诱导滋养细胞自身凋亡中起协同作用，两者共同促进滋养细胞自身凋亡增加，影响叶状绒毛膜的结构和功能，导致滋养细胞浸润蜕膜的能力下降，胎盘血管网形成不良，导致物质交换障碍，影响水循环及其调节，从而使母体、胎儿及胎盘之间的物质交换及水的运动降低，参与羊水过少的发生。 羊水过少的病因及发病机制尚未明确，Caspase3 及 Bcl-2 蛋白在羊
16、水过少的胎盘组织中的异常表达，对羊水过少的诊断及治疗提供了重要参考价值，确切机制有待于进一步研究。我们期望通过扩大样本量，进行多变量分析和研究，寻找羊水过少发生的生物学特性, 从而揭示其发生、发展的规律, 为羊水过少的预防、早期诊断和有效治疗提供新的研究思路和方法。 【参考文献】 1 乐 杰妇产科学 M 第 6 版北京：人民卫生出版社，2004：135-137. 2 Ota H ， Igarashi S， Sasaki M, et al. Distribution of cyclooxygenase-2 in eutopic and endometrium in endometriosis and adenomyosis J .Hum Reprod，2001，16(3)：561-566. 3 尹 伶，濮德敏，韦立蓓, 等. Caspase3 在 NS-398 诱导宫颈癌 Hela 细胞凋亡
