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1、117 雌二醇对人桡动脉舒张作用的体外实验作者：苏海川，赵玉红 ，韦耿泽，陈军，李陕区 【摘要 】 目的： 研究 17 雌二醇（17estradiol, E2）对人桡动脉(RA)的舒张作用及其机制. 方法： 采用离体血管灌流的方法，观察 E2 对人 RA 的舒张作用以及 NO 合成酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(NnitroLarginine methyl ester, LNAME)，8BrcGMP 和鸟苷酸环化酶抑制剂美蓝(MB)对这一过程的影响. 结果： 观察到 E2(0.1100 mol/L)可剂量依赖性地舒张血管且具有内皮依赖性；8BrcGMP(0.11103 mol/L)也可引起剂量依赖
2、性的血管舒张效应. 10 mol/L MB 使 E2 舒张人 RA 的作用完全消失. 10 mol/L LNAME 能部分抑制 E2 舒张 TA 的作用. 结论： E2 对 RA 的急性舒张作用具有内皮依赖性. 此作用是 E2 通过非基因组方式使血管内皮细胞分泌 NO、进而可能引起血管平滑肌细胞内的 cGMP 水平升高实现的. 【关键词】 雌二醇；桡动脉；一氧化氮； 环 GMP0 引言绝经前妇女心血管疾病发病率明显低于同龄男性和绝经后妇2女，说明雌激素具有很强的心血管保护作用1. 动物研究表明，雌激素能够通过非基因组途径快速舒张血管，雌激素的快速舒血管作用可能是雌激素促进了血管内皮细胞释放 N
3、O，进而抑制平滑肌细胞的收缩2. 有报道，雌激素可以直接抑制血管平滑肌细胞的收缩作用，产生舒血管作用3. 然而，雌激素作用于血管的确切机制还未完全清楚，雌激素对人动脉的作用及其机制也少见报道. 我们采用离体灌流人桡动脉环，观察雌激素对保留内皮和去内皮血管的急性舒张作用，并进一步研究这种舒张血管的作用机制.1 材料和方法1.1 材料人桡动脉由西京医院心血管外科取材自 10 例行冠状动脉旁路移植术的男性患者，年龄 4565 (558)岁. 17 雌二醇、左旋硝基精氨酸甲酯(NnitroLarginine methyl ester, LNAME)、美蓝（MB ） 、8BrcGMP 、去甲肾上腺素（N
4、E） （美国 Sigma 公司） . RM6280 多道智能生理记录及分析处理系统（第四军医大学生物医学工程系）.1.2 方法1.2.1 主要药物配制 17 雌二醇用 DMSO 配制成 10 mmol/L 的原液，实验前用 Krebs 液稀释成工作液. 3LNAME,MB 用去离子水配成 10 mol/L 原液，实验时加入Krebs 液，工作浓度为 10 mol/L. 8BrcGMP 直接用 Krebs 液配成工作液（0.11000 mol/L）. Krebs 液成分（mmol/L）：NaCl 118, KCl 4.75, CaCl2 2.54, KH2PO4 1.19, MgSO4 1.19
5、, NaHCO3 25, 葡萄糖 10，充以含 950 mL/L O2 和 50mL/L CO2的混合气，用 HCl 调 pH 至 7.27.4.1.2.2 离体血管环灌流将游离的 RA 放入到预冷、充以含 950 mL/L O2 和 50 mL/L CO2 Krebs 液中，仔细去除血管上的脂肪及结缔组织，将动脉剪成 23 mm 的小段，然后将血管环套在不锈钢小钩上，放入 37, 充以含 950 mL/L O2 和 50 mL/L CO2的 Krebs 液中， 并连接在张力传感器上. 给血管环加 0.5 g 的前负荷，在 Krebs 液中平衡至少 120 min 以上，在此过程中，孵育血管环
6、的液体每 15 min 换 1 次，并使前负荷维持在 0.5 g. 加入 10 mol/L 的 NE 检测标本活性（收缩幅度小于 500 mg 者弃去） ，然后冲洗使血管张力恢复到基线. 稳定 30 min 后重复给予 NE，待血管收缩达到稳定值时逐步增加 E2 的浓度（ 0.1100 mol/L）. 去内皮采用细钢丝插入血管腔中滚动完成. 用 10 mol/L 的乙酰胆碱（Ach ）对血管环是否有舒张反应作为判断血管内皮是否完整的标准.统计学处理： 血管环的例数 n 等于提供血管的患者数. 以4NE 对血管环收缩的最大效应为 100%. 制作累积浓度 舒张反应曲线，求出最大舒张反应值（Rma
7、x）和血管最大舒张的半数有效浓度（EC50）. 统计学处理采用组间 t 检验， P0.05 为差异显著.2 结果2.1E2 对人桡动脉的作用人桡动脉血管环用 1 mol/L 的 NE产生张力，待稳定后加入 E2 (0.1100 mol/L). 数据用 1 mol/L NE 预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. NE 使保留内皮或去内皮的 HIMA 收缩后， E2 可引起剂量依赖性的舒张效应，且具有内皮依赖性(图 1).图 1E2 对人桡动脉舒张的量效关系（略）2.28BrcGMP 对人桡动脉的作用人桡动脉血管环用 1 mol/L NE 产生张力，待稳定后，加入 8BrcGMP (0.110
8、00 mol/L). 数据用 1 mol/L NE 预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. NE 使 RA 收缩后，8BrcGMP 可引起剂量依赖性的舒张效应(图 2)，8BrcGMP 的浓度为 1000 mol/L 时，Rmax=(908)%，EC50=-4.70.3(log10mol/L).图 28BrcGMP 对人桡动脉舒张的量效关系（略）52.3LNAME 对 E2 舒张人桡动脉的影响人乳内动脉血管环用1mol/L NE 产生张力，待稳定后加入 E2 (110-41 mol/L). 一些血管环在加入 E2 之前 20 min 用 LNAME(10 mol/L)预处理，数据用 1 mo
9、l/L NE 预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. LNAME 可以使 E2 舒张 RA 的作用完全消失(图 3).图 3LNAME 和 MB 对 E2 舒张人乳内动脉效应的影响（略）2.4MB 对 E2 舒张人桡动脉的影响人乳内动脉血管环用 1 mol/L NE 产生张力，待稳定后加入 E2 (110-41 mol/L). 一些血管环在加入 E2 之前 20 min 用 MB (10 mol/L)预处理，数据用 1 mol/L NE 预收缩的血管舒张到未加药前的百分数表示. 10 mol/L 的 MB 可以使 VNP 舒张 HIMA 的作用完全消失.3 讨论E2 的急性舒血管作用为非基因
10、组机制，雌激素受体 和 都可能参与其中，以往报道，其效应呈内皮依赖性和内皮非依赖性，NO 在雌激素的舒血管作用中起关键的作用 4-5. NO 分泌后可以激活血管平滑肌细胞中的 GC，使细胞内 cGMP 浓度升高，进一6步激活 PKG，产生舒血管作用6 . 这些研究是以动物为研究对象得到的实验结果，而 E2 对人桡动脉的作用还少见报道 . 本实验采用冠状动脉旁路移植术使用的桡动脉来观察 E2 对其的作用. 我们的结果显示：E2 对人 RA 的舒张为内皮依赖性的，而NOS 抑制剂 LNAME 可以完全抑制 E2 的舒张作用，说明雌激素的急性舒血管作用依赖于血管内皮分泌的 NO. GC 抑制剂 MB
11、 抑制E2 对 RA 的舒张作用程度与 LNAME 大致相等，用 cGMP 类似物8BrcGMP 同样能够产生强烈的舒血管作用，且与 E2 的舒血管作用相似，进一步阐明了 E2 的舒血管作用有赖 NOcGMP 通路的参与. NOcGMP 通路激活 GC，升高细胞内重要的第二信使cGMP，通过 cGMP 的介导，激活 PKG，PKG 通过以下机制产生舒血管作用： 抑制 L型钙通道，减少钙内流，增加钙泵对钙的摄取，从而降低细胞内游离的钙离子浓度； 直接作用于收缩蛋白而使血管舒张； 在某些血管组织中，PKG 还可特异性抑制磷酸二酯酶活性，阻止 cAMP 降解而加强 cAMP 介导的舒张作用； 活化
12、K+通道，加速细胞复极化，抑制钙内流7. 我们的结果表明LNAME 和 MB 可以完全阻断 E2 的舒血管作用，提示 E2 激活NOcGMP 通路产生舒血管效应8 . E2 的快速舒血管作用为内皮依赖性，说明血管内皮细胞在 E2 的刺激下分泌 NO 增加，引起血管舒张. 这与 Geary 等9 在小鼠大脑动脉的研究是一致的. 7Binko 的研究发现10： 去内皮后的大鼠胸主动脉急性暴露 10-6 mol/L 的 E2 10 min 后并没有明显减弱新福林引起的收缩作用，而与 E2 孵育 24 h 后，可以明显减弱新福林收缩血管的程度，并活化平滑肌细胞 NOS，刺激 NO 的表达和分泌. 总之
13、，E2 对 TA 具有依赖内皮的舒张作用. 它作用于血管内皮细胞促进 NO 的释放，激活 NOcGMP 通路，舒张血管. 这是以非基因组的方式快速舒张 TA.【参考文献】 1 Stampfer MJ, Colditz GA, Willett WC, et al. Postmenopausal estrogen therapy and cardiovascular disease. Tenyear followup from the nurses health studyJ . N Engl J Med, 1991,325:756-762.2 Cruz MN, Douglas G, Gustaf
14、sson JA, et al. Dilatory responses to estrogenic compounds in small femoral arteries of male and female estrogen receptorbeta knockout miceJ . Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2006,290(2):H823-829.3 Leung HS, Seto SW, Kwan YW, et al. Endotheliumindependent relaxation to raloxifene in porcine 8corona
15、ry arteryJ. Eur J Pharmacol， 2006, 20, Epub ahead of print.4 Nevala R, Paukku K, Korpela R, et al. Calciumsensitive potassium channel inhibitors antagonize genistein and daidzeininduced arterial relaxation in vitroJ . Life Sci, 2001, 69(12):1407-1417.5 Dubey RK, Oparil S, Imthurn B, et al. Sex hormones and hypertensionJ. Cardiovasc Res, 2002,53(3):688-708. 6 Mendelsohn ME, Karas RH. The protective effects of estrogen on the cardiovascular systemJ . N Engl J Med, 1999,340(23):1801-1811.7 Lincoln TM, Dey N, Sellak H. cGMPdependant protein kinase signaling mechanisms in sm
