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1、1LRP 及 GST的表达与非小细胞肺癌的耐药性关系作者：姬明丽,千智斌, 宋晓荣 【摘要 】 目的 探讨 NSCLC 的化疗耐药性和参与介导多药耐药的相关基因和蛋白 LRP 及 GST 的表达，对比分析 NSCLC 的多药耐药性与上述二种耐药相关基因表达的关系。方法 应用肿瘤细胞体外培养和 MTT 法对 91 例未经化疗的 NSCLC 进行体外化疗药物敏感性测试，观察 NSCLC 分别对环磷酰胺、阿霉素、顺铂+5Fu三种单药和联合用药方案耐药情况和总的耐药情况，并用免疫组织化学方法对其进行 3 种耐药相关基因（ LRP、MRP 及 GST）表达的检测,并将其表达情况与对应的化疗耐药性进行相关
2、分析。结果 91 例 NSCLC 化疗敏感性检测结果显示：53 例（58.2%）对环磷酰胺耐药，51 例（56.0%）对阿霉素耐药，42 例（46.2%）对顺铂+5Fu 耐药。其中，19 例（20.9%）对三种用药均敏感， 27 例（29.8%）对三种用药均耐药，其耐药性与组织学类型和分化程度无关（P0.05） 。LRP 和 GST 在 91 例 NSCLC 中总的阳性表达率分别为：53.8和 64.8%。鳞癌和腺癌相比 LRP 和 GST 的表达无显著性差异（P0.05） 。且 LRP 和 GST 的表达与对三种化疗用药的耐药性均呈显著正相关 (P0.05)，并且不同表达程度间2也有显著差异
3、性 (P0.05)。结论 LRP 和 GST 在 NSCLC 中均有较高的阳性表达并共同介导参与了 NSCLC 固有多药耐药机制。 【关键词】 NSCLC；多药耐药； LRP 基因；谷光甘肽转移酶 基因；体外药敏试验；免疫组织化学The Effection of LRP and GST in Mechanism of Drug Resistance of Nonsmall Cell Lung CancerKey words：Nonsmall lung cancer;Multidrug resistance;Lung resistancerelated protein gene;Glutathi
4、one stransferases;In vitro chemosensitivity assay;Immunohistochemisty化疗是对失去手术机会及术后复发的非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer,NSCLC）患者治疗的一个重要手段，但由于多药耐药的（multidrug resistance，MDR ）产生常导致化疗失败。本实验应用肿瘤细胞体外培养、MTT 法和免疫组织化学对 91 例NSCLC 的化疗耐药性与肺耐药蛋白（lung resistancerelated protein，LRP ）及谷光甘肽转移酶 (glutathione stransfera
5、ses,GST)的表达关系进行研究，现报道如下。31 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 材料收集 2001 年 9 月2002 年 10 月间新乡医学院第一附属医院、新乡医学院第三附属医院胸外科手术切除的 NSCLC 新鲜标本 91 例。所有患者术前均未接受过化、放疗。每例标本分为两份，一部分立即消化后用于药敏试验；另一部分常规 10%福尔马林固定、石蜡包埋、连续 5m 切片，用于免疫组化染色检查相关耐药基因的表达情况。1.1.2 主要试剂及培养基小牛血清、RPMI1640 、胶原酶型为Gibco/BRL 公司产品；二甲基亚砜、噻唑蓝为 Sigma 公司产品。1.1.3 化疗药物及配制(1
6、) 化疗药物环磷酰胺（Cyclophamide） 、阿霉素（Adriamycin）为北京协和制药厂产品；顺铂（Cisplatin） 、5Fu为旭东海普药业有限公司产品。(2) 药物浓度及配制均采用药物在人体内的血浆高峰浓度为药敏测试的药物浓度。41.1.4 免疫组织化学试剂鼠抗人 LRP 单克隆抗体（LRP56 ） 、鼠抗人 GST 单克隆抗体（A3600） 、PV6000 通用型二步法免疫组化试剂盒、浓缩型 DAB 试剂盒及免疫组织化学染色常用试剂,均购于北京中山生物技术有限公司。1.2 实验方法1.2.1 药敏实验（MTT 法）参照文献1 进行。药物敏感性判断标准2：肿瘤细胞生长抑制率30
7、%为耐药， 31%50%为低度敏感，51%70%为中度敏感，70%为高度敏感。1.2.2 免疫组织化学染色及判断标准染色方法 按 PV6000 通用型二步法免疫组化试剂盒说明书进行。结果判断，参照文献3 进行。1.3 统计学处理采用卡方检验、KruskaiWallis Test 和Spearman Test，均借助 SPSS10.0 软件完成。2 结果2.1NSCLC 的化疗耐药性52.1.1 总体耐药情况 53 例（58.2%）对环磷酰胺耐药，51 例（56.0%）对阿霉素耐药，42 例（46.2%）对顺铂 +5Fu 耐药。其中，19 例（20.9%）对 3 种用药均敏感， 27 例（29.
8、8% ）对 3 种用药均耐药,见表 1。表 191 例 NSCLC（鳞癌 50 例，腺癌 41 例）对三种用药方式的耐药情况2.1.2 组织学类型与化疗耐药性的关系不同组织学类型（鳞癌和腺癌）的 NSCLC 的化疗耐药性无差异（P0.05）, 见表 2。表2NSCLC 组织学类型和分化程度与耐药的关系鳞癌与腺癌相比；高分化与中分化相比；低分化与高分化和中分化相比。2.1.3 分化程度与化疗耐药性的关系 比较分化程度与化疗耐药性的结果显示：鳞癌：高分化与中分化间无差异（P0.05） ，但二者与低分化相比，低分化鳞癌对所用化疗药物和药物联合明显敏感（P 0.05） 。腺癌：高、中、低分化间均无差异
9、（P0.05） ，但 3例低分化腺癌对所用化疗药物和药物联合均敏感，见表 2。2.2 耐药相关基因表达与 NSCLC 耐药性的关系2.2.1LRP 在 NSCLC 的表达与化疗耐药性的关系（ 1）LRP 在 NSCLC 的表达及与化疗耐药性的关系 LRP 阳性部6位定位于细胞浆，呈棕黄色,见图 1、2 。91 例 NSCLC 中 LRP 阴性者 42 例（包括鳞癌和腺癌，46.2%） ，阳性者 49 例（包括鳞癌和腺癌，53.8%） 。鳞癌和腺癌相比 LRP 的表达无显著性差异（P 0.05） ，见表 3。表 3LRP 、GST 在 NSCLC 中的表达组织学类型 LRP 表达 GST 表达-
10、+-+ 鳞癌261212171815 腺癌 16817151115（ 2）NSCLC 中 LRP 的表达与耐药性的关系 LRP 的表达在NSCLC 的组织学类型（鳞癌和腺癌）间无显著性差异，故对其表达与 NSCLC 耐药性的关系也未进行组织学类型的分解，结果显示：对于三种化疗用药方案，LRP 的表达与 NSCLC 的耐药性均呈显著的正相关（P0.05） ；其不同表达程度间也有差异性显著（P 0.05） ，见表 4。表 4LRP、GST 的表达与 NSCLC 化疗耐药性的关系方案 LRP 表达 GST 表达-+-+ 环磷酰胺耐药8162971630 敏感 344025130 阿霉素 耐药 815
11、2861629 敏感345126131 顺铂+5Fu 耐药 0142801428 敏感 4261321522.2.2GST 在 NSCLC 的表达及与化疗耐药性的关系（ 1）GST 在 NSCLC 中的表达 GST 阳性部位定位于细胞7浆，呈棕黄色，见图 3、4 。91 例 NSCLC 中 GST 阴性者 32 例（包括鳞癌和腺癌，35.2%） ，阳性者 59 例（包括鳞癌和腺癌，64.8%） 。鳞癌和腺癌相比 GST 的表达无显著性差异（P0.05） ，见表 3。（ 2）NSCLC 中 GST 的表达与耐药性的关系 GST 的表达在 NSCLC 的组织学类型（鳞癌和腺癌）间无显著性差异，故对
12、其表达与 NSCLC 耐药性的关系未进行组织学类型的分解，结果显示：对于三种化疗用药方案，GST 的表达与 NSCLC 的耐药性均呈显著正相关（P0.05） ；其不同表达程度间也有显著性差异（P 0.05） ，见表 4。3 讨论本研究对 91 例 NSCLC 化疗敏感性检测结果显示：53 例（58.2% ）对环磷酰胺耐药，51 例（56.0%）对阿霉素耐药，42 例（46.2%）对顺铂+5Fu 耐药。其中，19 例（20.9% ）对三种用药均敏感，更有 27 例（29.8%）对三种用药均耐药，说明部分 NSCLC 有着固有的化疗耐药性。目前 NSCLC 诱导化疗的总缓解率一般在 70%左右4，
13、与本研究结果相符。本研究结果还显示：不同组织学类型（鳞癌和腺癌）的 NSCLC 化疗耐药性无差异（P 0.05） ；比较分化程度与化疗耐药性的结果显示：鳞癌：高分化与中分化间无差异8（P 0.05） ，但二者与低分化相比，低分化鳞癌对所用化疗药物和药物联合明显敏感（P0.05） 。腺癌：高、中、低分化间均无差异（P 0.05） ，但所有 3 例低分化腺癌对所用化疗药物和药物联合均敏感，说明低分化者对所用化疗药物和药物联合有较好的敏感性。有研究5表明肿瘤在未接触化疗药物前已存在有 MDR 基因的表达，从本实验的结果来看，有 46.2%58.2%的 NSCLC 在化疗前已存在着对多种化疗药的耐药性
14、，与此相符。作为构成人体穹隆蛋白（major vault protein ，MVP）的主要成分，LRP 广泛分布在人体体腔上皮、分泌器官等正常组织中，与Ppg、MRP 一样，LRP 的主要作用是清除外源性毒性物质，使机体免受损害，其作用机制阻止以细胞核为靶点的药物通过核孔进入细胞核，并将药物转运到细胞浆的囊泡中，以胞吐的方式排到细胞外5。有研究证实 LRP 参与多种肿瘤对多种化疗药物的耐药6，但 LRP 在 NSCLC 的表达和与耐药关系的研究较少。本研究发现LRP 在 NSCLC 中阳性表达为 53.8%，表明 LRP 在 NSCLC 中有着较高而强的阳性表达，提示 LRP 在 NSCLC
15、的固有化疗耐药机制中起着一定的作用。本研究发现 91 例 NSCLC 中 LRP 的表达与对环磷酰胺、顺铂+5Fu 、阿霉素的耐药性均呈显著正相关，并随表达程度的增加而增加（P0.05 ） ，说明在 NSCLC 中 LRP 参与了阻止顺铂和 5Fu 等对肿瘤细胞 DNA 的破坏，并且通过胞吐作用对阿霉素影响转录的作用予以限制。故化疗前对 NSCLC 的 LRP 表达9的检测，对于预测 NSCLC 对上述药物的耐药有着积极的指导意义。GSTs 是一多基因家族，目前已发现有 、 、 和膜结合型5 种同工酶，不仅可做为肿瘤转化的标志，而且能催化谷胱甘肽（GSH）与亲电性物质如抗癌药物结合，通过的活性
16、将抗癌药物排出细胞，是肿瘤细胞对抗癌药物的代谢和运输能力增强，从而使肿瘤产生耐药性，而且很多对常规化疗药物耐药的细胞株的 GSTs 活性较高，GST 是 GST 的几种同工酶中表达最高的一种5。本研究发现 GST 在NSCLC 的阳性表达率为 64.8%，也证明 GST在 NSCLC 中有着高而强的阳性表达，提示 GST 可能是介导 NSCLC 固有耐药性的主要原因之一。有关 NSCLC 中 GST 表达与以顺铂为主的诱导化疗疗效分析的研究表明，GST 高表达患者的生存期明显低于低表达者，且 GST 高表达与 p53 突变显著相关，说明 GST 通过外排顺铂抑制了由顺铂导致的 p53 依赖的肿瘤
