《B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达》由会员分享，可在线阅读，更多相关《B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达（14页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1B 区缺失的人凝血因子基因在 293T 细胞表达作者：程海，徐开林， 孙海英， 杜冰， 曾令宇， 鹿群先， 何徐彭， 潘秀英【摘要 】 本研究目的是构建含有人凝血因子(F)基因的慢病毒载体，观察其在 293T 细胞中的表达情况。 用限制性内切酶法获得 B 区缺失的人凝血因子基因(BDDhFcDNA)片段, 将其克隆至慢病毒载体 pXZ208，构建了慢病毒表达载体pXZ208BDDhF ；用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向，用磷酸钙共沉淀法将重组质粒 pXZ208BDDhF 分别与包装质粒NRF、包膜蛋白质粒 VSVG 共转染 293T 包装细胞，包装后感染293T 细胞，并以 pXZ171
2、作为对照。在感染后用逆转录 聚合酶链反应(RTPCR) 检测 BDDhF基因的转录，一期法检测细胞培养上清 F的活性，流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率，PCR 检测BDDhF基因的整合。结果表明： 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208BDDhF ，其基因转导染效率达到了 59.57%。RTPCR法能够检测到 BDDhF转录的 mRNA。感染后 24、48、72 小时检测到细胞上清中 F活性(FC)分别为12%、43%、87%。PCR 法扩增出了 534 bp 的特异性片段。结论：成功构建的慢病毒表达载体 pXZ208BDDhF ，在体外可以有效2感染 293T 细胞并表达有活性的 F，提
3、示基因治疗可应用于血友病A。 【关键词】 慢病毒Expression of B DomainDeleted Human Coagulant Factor Gene in 293T Cells Mediated by Lentiviral Vector In VitroAbstract This study was aimed to construct a lentiviral vector carrying human coagulant factor (F) and to investigate its expression in 293T cells. Bdomaindeleted fac
4、tor gene fragment (BDDhFcDNA) was obtained by enzyme digestion and cloned into lentiviral vector pXZ208 to establish the expression vector pXZ208BDDhF. Recombinant viral particles were prepared by cotransfection with packaging plasmid NRF and envelope plasmid VSVG using calcium phosphate precipitati
5、on method. 293T cells were transfected by viral supernatant. Coagulant activity of F， BDDhFmRNA and genome integration were assayed by onestep method, RTPCR and PCR after transfection. The results showed that 293T cells could be transfected by recombinant virus. The transfection rate of 293T was 59.
6、57%. 3After transfection, the cells expressed F efficiently. Detection confirmed that the activity of F was 12%,43% and 87% respectively at 24,48 and 72 hours after infection. BDDhF transcription was detected by RTPCR from the infected cells. The gene integration in the targeted cells was also obser
7、ved. It is concluded that the successfuly constructed lentiviral vector is able to generate high level expression of human F in 293T cells, which may provide a potential application of gene therapy to haemophilia A.Key words lentiviral vector； coagulant factor ； gene expression血友病 A 是一种 X 连锁隐性遗传性出血性
8、疾病，目前对该病的治疗主要以蛋白替代疗法为主，但是有感染人免疫缺陷病毒(HIV)和病毒性肝炎等传染病的危险1-3 。随着分子生物学技术的发展，基因治疗成为根治血友病 A 的一种理想模式。目前以病毒载体为基础的基因治疗的研究已经广泛开展，其中来源于人免疫缺陷病毒I(HIVI)的慢病毒载体具有免疫原性小、可以稳定整合到宿主的染色体，有利于目的基因长期表达。为了探讨慢病毒载体治疗血友病4A 的可行性，我们构建了含有人凝血因子(F)基因的重组慢病毒载体，并观察其在人胚肾细胞(293T)细胞中的表达。材料和方法材料菌株 E Coli DH5、慢病毒载体 pXZ208、pXZ117(含有编码增强型绿色荧光
9、蛋白的基因片段，EGFPcDNA)为本室保存。pDLZ6(含有 B 区缺失的人凝血因子 片段，BDDhFcDNA)由美国北卡罗来那大学的晁恒军博士惠赠。 293T 细胞由本实验室冻存。DMEM 购自 Gibco 公司。胎牛血清(FBS)购自杭州四季青公中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)B 区缺失的人凝血因子在 293T 细胞中的表达司。各种工具酶、1 kb DNA Ladder、质粒小量提取试剂盒（WizardTMPlus SV Minipreps DNA Purification System） 、质粒中量提取试剂盒（ PureYieldTM Plasmi
10、d Midipre System） 、目的基因纯化试剂盒（WizardTM PCR DNA Purification System） 、线性化载体回收试剂盒（WizardTM DNA CleanUp System） 、反转录试剂盒（Access RTPCR System） 、 PCR 扩增试剂盒（PCR Master Mix） 、RNA提取试剂盒（RNAgents Total RNA Isolation System）均购自Promega 公司。Factor Deficient Plasmas 购自美国的 Pacific 5Hemostasis 公司。慢病毒表达载体的构建和鉴定采用限制性内切酶
11、 Xhol I 单酶切载体 pDLZ6，得到 4 435 bp的目的基因 BDDhFcDNA，低熔点凝胶回收后插入到慢病毒载体pXZ208 的 Xhol I 位点，Xhol I、Kpn I 单酶切鉴定重组子。将正确连接的重组子命名为 pXZ208BDDhF 。细胞培养DMEM 加 10% FBS 常规培养 293T 细胞 ,每 2-3 天 换液 1 次, 胰酶消化传代,倒置显微镜下观察细胞的生长状况。重组慢病毒的包装采用磷酸钙共沉淀法4 将重组质粒 pXZ208BDDhF(15 g)分别与包装质粒 NRF(10 g)、包膜蛋白质粒 VSVG(5 g)共转染 293T 包装细胞，用无血清的培养基
12、在 37、5% CO2 条件下培养 3 小时后，加入 FBS,使其终浓度达到 10%，12 小时后更换全部培养液，37、5% CO2 条件下继续培养。72 小时后收集病毒上清，过滤后-80 保存。同时以携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)6基因的慢病毒载体 pXZ171 作为对照，观察 GFP 表达情况。病毒滴度的测定将 293T 细胞按照 2105/孔接种于 6 孔板上，吸附 6 小时后，将所收集的含 pXZ171 的病毒上清分别按对数级稀释，将 1 ml 稀释后的病毒上清分别加入到相应的孔中，过夜培养后，更换培养基，48 小时后，于荧光显微镜下计数荧光阳性细胞个数，并计算病毒滴度，用流式细胞
13、仪（FACS）检测 GFP 阳性细胞百分率。病毒滴度的计算公式为：病毒滴度（U/ml） =GFP 阳性细胞数相应的稀释倍数 5 感染靶细胞将细胞 293T 以 1106 的密度接种于培养瓶中，在 37、5% CO2 条件下培养 24 小时后换以新鲜培养液，加入 5 ml 的重组慢病毒上清液，同时加入 polybrene 使其终浓度为 8 g/ml，轻轻混匀后，继续培养 48 小时后，荧光显微镜下观察 GFP 表达情况，并用FACS 检测病毒的感染效率。7细胞培养上清中凝血因子活性(FC)的检测取感染后 24、48、72 小时的细胞培养上清液，一期法检测 F活性。细胞中 BDDhF mRNA 的
14、转录感染后 48 小时收集培养细胞(约 5 106 个) ，RNAgents Total RNA Isolation System 试剂盒提取细胞的总 RNA，按照Access RTPCR System 试剂盒的操作说明，用逆转录 聚合酶链反应(RTPCR) 检测细胞中 BDDhFmRNA 的转录。设计 1 对BDDhFcDNA 的特异性引物，上游引物序列为：5TTCTCCCCAATCCAGCTGG3，下游引物序列为：5GAGTTATTTCCCGTTGATGG 3，扩增片段为 534 bp。逆转录条件为 42 10 分钟，95 5 分钟。PCR 扩增条件为 95 2 分钟 ，95 1 分钟,
15、55 1 分钟，72 1 分钟，72 4 分钟，30个循环后电泳观察结果。BDDhF cDNA 基因的整合将感染后的细胞传代培养，传代 3 次后收集细胞，按照试剂盒8的操作说明书提取细胞的基因组，PCR 法检测基因的整合。上游引物序列为 5TTCTCCCCAATCCAGCTGG3，下游引物序列为5GAGTTATTTCCCGTTGATGG 3，扩增片段为 534 bp。PCR扩增条件为 95 2 分钟 ，95 1 分钟， 55 1 分钟，72 1 分钟，72 4 分钟，30 个循环后，电泳观察结果。结 果重组慢病毒表达载体 pXZ208BDDhF 的鉴定构建的重组质粒全长 13 018 bp。根
16、据酶切图谱，采用 Xhol I、Kpn I 分别单酶切重组质粒，当连接正确时，用 Xhol I 单酶切重组质粒后得到 4 435 bp 和 8 583 bp 两个片段；用 Kpn I 单酶切重组质粒后得到 3 341 bp 和 9 677 bp 两条片段(图 1)。慢病毒的包装采用磷酸钙共沉淀法将 pXZ208BDDhF 分别与 NRF、VSVG 共转染 293T 包装细胞，并以 pXZ171 作为对照。24 小时后即可观察到 GFP 的表达，48 小时后 GFP 荧光强度明显增强(图 2)。72 小时收集病毒上清，经 0.45 m 滤膜过滤后保存于-80。9Figure 2. GFP expression i
