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1、1Caspase3 在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞凋亡中作用 作者：杜红俊，惠延年，王雨生，韩泉洪，马吉献 【关键词】柔红霉素 关键词: 柔红霉素;视网膜色素上皮;caspase-3;凋亡 摘要: 目的探讨天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（caspase）成员 caspase-3 在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮（RPE）细胞凋亡中的变化 .方法原代培养的人 RPE 细胞经 200gL-1 柔红霉素诱导 8，24 和 36h 后，按照 caspase-3 荧光检测试剂盒说明处理细胞，再通过荧光比色法间接检测细胞碎片中 caspase-3的活性.结果正常 caspase-3 的活性为（0.
2、0940.005 ）nmolAFC，8h 后增加为（0.4460.029） nmolAFC，24h 后为（0.7540.056）nmolAFC，36h 又下降到（ 0.4860.033）nmolAFC，但都高于正常水平（P0.01）.加入特异性四肽抑制物 DEVD-CHO1L 后活性为（0.0400.003）nmolAFC，显著低于正常（P0.01） .结论 Caspase-3 参与了柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡，柔红霉素可使其活性增加. 2Keywords:daunorubicin;retinalpigmentepithelium;cas-pase-3;apoptosis Abs
3、tract:AIMTostudythefunctionofcaspase-3activityduringdaunorubicininducedhumanretinalpigmentepitheli-umcellapoptosis.METHODSAfterbeingtreatedwith200molL-1daunorubicinfor8，24and36h，theprimarycul-turedhumanretinalpigmentepitheliumcellsweretreatedbyfollowingtheprotocolofaspecificassaykit，thentheshiftoffl
4、uorescenceemissionwasdetectedtodeterminetheactivityofcaspase-3indirectly.RESULTSThemeanactivityofthenormalgroupwas（0.0940.005）nmolAFC，andthoseofinducedgroupswere（0.4460.029 ）nmolAFC， （0.7540.056）nmolAFC， （0.4860.033）nmolAFC，at8，24and36hrespectively.Theywereallhigherthanthoseofnormalgroup（P0.01）Thefo
5、urpeptidesinhibitor-DEVD-CHOdecreasedtheactivityto（0.0400.003）nmolAFC（P0.01 ）.CONCLUSIONCaspase-3isinvolvedindaunoru-bicininducedhumanretinalpigmentepitheliumcellapopto-3sis，anddaunorubicincouldraisetheactivityofcaspase-3. 近来研究发现，天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶（caspases）与凋亡效应器、细胞色素 C（CytC ）和 Bcl-2 蛋白家族间相互作用，参与细胞凋亡
6、的调控和执行，是影响细胞凋亡的重要因素.其中 caspase-3 在凋亡的执行阶段起作用1.以往的研究已经证实，柔红霉素可以诱导体外培养的人视网膜色素上皮（retinalpigmentepithelium，RPE）细胞发生凋亡，癌基因 bcl-2和 bax 参与了对凋亡的调节2-5.但在此凋亡模型中有无caspase-3 的参与尚未见文献报道，为此我们进行了以下实验. 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM 培养基（Gibco 公司） ，柔红霉素（意大利FarmirtaliaCarioErba） ，caspase-3 荧光检测试剂盒（Clontech公司） ，胰蛋白酶（Gibco 公司）. 用
7、作者以往报道 4中 36 代的细胞进行实验. 1.2 方法 将 RPE 细胞传代接种于 75mL 培养瓶，待细胞长至约 85%时，参照以往实验的条件2 ，加入浓度为 200gL-1 的柔红霉素4进行凋亡的诱导.实验分组如下: 抑制物组，即不加柔红霉素培养24h，样本处理中加入特异性抑制物 DEVD-CHO;正常对照组，即不加柔红霉素培养 24h;200gL-1 诱导 8h;200gL-1 诱导24h;200gL-1 诱导 36h.处理结束后参照试剂盒说明进行酶活力检测，具体程序如下:除正常对照组设 5 个平行管外，其余每组设 4个平行管，每管 1106 个细胞;用 50L 细胞裂解液裂解细胞，
8、冰浴10min.细胞裂解物经 8500g 离心 3min（4）后收集上清到另一离心管中;抑制物组，即加入 2反应缓冲液 50L（含 4mmolL-1的 DTT）和 1L 的 DEVD-CHO 抑制剂到 50L 上清，37 水浴30min，然后进行步骤 ;加入上述 2反应缓冲液 50L 到其他各管;每管中加入 1mmolL-1 交联底物 5L，37水浴 1h.正常培养细胞组中取出 1 管不加底物用于检测时仪器的调零;荧光比色检测仪检测，激发波长 400nm，发射波长 505nm，读取数值.实验中采用倒置显微镜常规进行细胞形态的观察. Caspase-3 活性单位的定量: 用细胞裂解缓冲液稀释 8
9、0molL-1AFC（7-amino-4-trifluoromethylcoumarin，AFC ） ，使终浓度分别为 0，0.5，1，2 和 4molL-1;用荧光检测仪测量以上 5 种浓度的液体，以 AFC 摩尔数为 X 轴，荧光单位（fluorescenceunits，FU）为 Y 轴，产生 AFC 标准曲线;用以下公式计算 caspasse-3 的活力:caspase-3=FU斜率-1（nmolAFCFU-1）. 统计学处理: 数据用 xs 表示，采用 ANOVA 方法进行统计学处5理. 2 结果 2.1RPE 的细胞形态 正常培养的 RPE 细胞呈现多角形扁圆形或梭形，贴壁生长，悬浮
10、细胞很少.处理结束时对照组细胞呈正常形态，瓶壁接近铺满.药物处理组细胞随着时间的延长，细胞形态变得不典型，细胞折光性变差，部分细胞表面变得粗糙，细胞结构不很清楚，而且细胞密度较正常低，同时悬浮细胞增加. 2.2caspase3 活性 8h 时已显著高于正常（P0.01 ） ，24h 时最高，36h 时有所下降，但仍高于正常（P0.01 ）.标准曲线的斜率为337FUnmolAFC-1（Tab1 ）.表 1 柔红霉素对培养人 RPE 细胞caspase-3 活性的影响（略） 3 讨论 近来人们认识到 caspases 在凋亡中起着重要作用.Caspases为 cysteinylaspartate
11、-specificpro-teinases 的缩写，即天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶.其中 caspase-63（CPP32/Yama/Apopain）在凋亡所需的细胞蛋白水解中起着直接的作用，其水解底物多是细胞中的功能蛋白质，分别参与 DNA修复、mRNA 裂解、固醇生物合成和细胞骨架重建等6-9 .应用检测蛋白水解酶活性的手段可以比其他方法更早检测到凋亡.我们所用试剂盒的原理在于:caspase-3 可以裂解交联在底物 DEVD 上的荧光物质 AFC，使其释放，再通过荧光比色法检测反应体系中的荧光强度，间接反映蛋白酶的活性.此方法简便、快速，灵敏，整个过程可以在 90min 内完成 .
12、我们前期的工作已经证实，200gL-1 柔红霉素作用 24h 可以诱导培养人 RPE 细胞产生凋亡 2，3 ，因而本实验中采用这一浓度进行诱导.实验结果显示，柔红霉素对细胞形态的影响同我们以往的报道类似，证实实验具有可重复性.在药物诱导 8h 时，已经有caspase-3 酶活性的增加，同未诱导组相比具有显著差异（P0.01） ，到 24h 时活性进一步增加，而到 36h 时活性则开始下降，但仍高于正常（P0.01 ）.这一结果证实， caspase-3 在柔红霉素诱导的人 RPE 细胞凋亡模型中起着一定作用 .目前认为，在多种细胞凋亡的过程中，bcl-2 和 bax 等癌基因产物可以调节线粒
13、体中 CytC 的释放，而后者则可以激活 caspase-3，进而引起特征性的细胞凋亡变化10，11. 我们以往的实验显示，柔红霉素可以促进 bax 基因的表达，bax 通过促进 CytC 的释放来激活 caspase-3.另外 bcl-2 家族的成员还可以通过其他途径影响 caspase-3 的激活，从而影响凋亡.实验中我们还发现，caspase-3 的活性可以被人工合7成的四肽 DEVD-CHO 特异性的抑制（P0.01）.我们的研究表明，在柔红霉素诱导的人 RPE 细胞凋亡模型中，有 caspase-3 蛋白酶活性的增加，即 caspase-3 蛋白酶参与了这一过程，而其抑制物可以抑制其
14、活化.这提示人们能够通过基因转染12 ，人工合成针对某种基因的反义核苷酸13或合成 caspase-3 特异性的抑制物和激活物等手段，直接或间接地影响 RPE 细胞的凋亡，从而治疗与 RPE细胞异常凋亡有关的疾病，如增生性玻璃体视网膜病变、视网膜色素变性和年龄相关性黄斑盘状变性等14， 15. 参考文献: 1NichosonDW，ThornberryNA.Caspases;killerproteasesre-view J .TrendsBiochemSci，1997;22（8）:299-306. 2WangYS，HuiYN.Expressionofbaxandbcl-2geneduringcu
15、lturedhumanretinalpigmentepithelialcellapoptosis J.ZhonghuaYandibingZazhi（ChinJOculFundusDis） ，1999;15（ 3）:153-156. 3WangYS，HuiYN.Transmissionelectronmicroscopeexamina-tionofculturedhumanretinalpigmentepithelialcellsduringapoptosisinducedbydaunorubicinJ.ZhonghuaYandibingZazhi（ChinJOculFundusDis） ，81
16、998;14（ 4）:228-229. 4WangYS，YanM.Photochemicalinjuryofvisiblelightoncul-turedhumanretinalpigmentepithelialcellJ .ZhonghuaYandibingZazhi（ChinJOculFundusDis） ，1996;12（ 3）:174-176. 5OsborneNN，CazevieilleC，PergandeG，WoodJP.InductionofapoptosisinculturedhumanretinalpigmentepithelialcellsiscounteractedbyflupirtineJ .InvestOphthalmolVisSci，1997;38（7） :1390-1400. 6
