数字PCR技术在临床中的应用 20210622

数字PCR技术在临床中的应用目录CONTENTS数字PCR的概念产品、技术对比数据数字PCR在临床中的应用ConceptofdPCRContrastDataApplication010203FOREVERGENConceptofdPCRPARTONE数字PCR的概念PCR技术的发展数字PCR技术原理数字PCR超高的灵敏度数字PCR技术特点数字PCR荧光定量PCR定量方式绝对定量，无需标准曲线相对定量，需要参考标准曲线检测试剂技术实验技术体系，基本一致；Taqman探针法、EvaGreen染料法兼容检测灵敏度基因突变检测灵敏度可达0.01%，基因绝对定量检测灵敏度可达单拷贝，基因拷贝数差异检测灵敏度可达0.1倍。较为依赖试剂盒的性能，目前较好的试剂盒基因突变检测灵敏度一般为1%，且价格昂贵；基因定量需依赖标准曲线，会因使用标准品的不同有所差异；基因拷贝数差异检测灵敏度为2倍。实验重复性重复性好，实验间、实验室间结果差异较小，无需依赖标准曲线或对照参考品进行定量重复性较差，严重依赖标准曲线，且实验室间及批次实验结果具有一定的差异PCR抑制物的敏感性终点判读法，受PCR抑制物影响较小过程判读，扩增效率易受PCR抑制物影响产品、技术对比数据ContrastDataPARTTWO各分子检测平台比较技技术检出限出限检测区域区域技技术特点特点难易度易度qPCR1%已知位点荧光素标记+ddPCR0.1%或更低已知位点绝对定量+Sanger10%全基因序列双脱氧链终止法+NGS1%（与测序深度相关）全基因序列大规模平行测序+l数字PCR优势:0.1%甚至更低的检测限；核酸检测，绝对定量；更高的分辨率和灵敏度；更高的准确性和可操作性，不同操作人员，实验室之间，不同批次可实现高度重现性和一致性；明确的位点检测，无需生物信息学人员介入，降低解读的不一致性。各厂家数字PCR技术比较厂商品牌技术路线检测原理ThermoFisherQuantStudio 3D 物理分割扫描拍照Bio-RadQX200液相分割流式永诺医疗MicroDrop-20液相分割流式StillaNaica Crystal 液相分割扫描拍照MicroDrop-20QX200Naica Crystal QuantStudio 3D Microdrop系列产品特点2分钟制备8个样本。20l体系生成10万/2万个纳升级的微滴。高精度微滴生成芯片设计，三维微纳防污结构支持FAM/VIC双通道荧光检测，支持探针法及染料法，支持多重数字PCR；样本通量高达96个样本，支持灵活设定；线性范围达到5-6个数量级，灵敏度高达0.01%。Microdrop产品特点国内首款拥有完全自主知识产权的微滴式数字PCR系统。采用主流可靠的解决方案，由样本制备仪、流式微滴检测仪及数据分析软件组成。油包水乳化微滴技术，在微管道中利用气压驱动生成10万/2万个微滴，单个微滴体积低至纳升级。线性范围达到5-6个数量级，灵敏度低至万分之一。半开放式平台，客户可自行开发试剂、项目。企业参考品MicroDrop-20QX200突变频率CV突变频率CV0.05%0.05%8.19%0.06%8.13%0.10%0.10%6.91%0.11%7.71%0.50%0.39%5.52%0.37%5.11%1.00%0.85%2.24%0.84%2.47%10.00%8.85%0.61%8.68%0.65%50.00%49.53%0.48%48.40%0.52%MicroDrop具有极佳的重复性：不同数字PCR平台结果高度一致horizon标准物准物质校正校正MicroDrop-20的准确度：horizon ctDNA标准物质校正偏差小突变频率MicroDrop-20检测结果0%0%0%0%0%0.1%0.12%0.11%0.11%0.13%1%0.98%0.95%1.05%1.11%5%4.89%5.14%5.03%5.06%NIST国国际标准物准物质校正校正MicroDrop-20的准确度：CMV国际标准物质校正相对偏差小企业参考品标定浓度（copies/L）实测浓度（copies/L）实测平均浓度（copies/L）相对偏差国际标准品HCMV/11796018936.9518585.653.48%18741.5918849.7617814.31国际标准品HCMV/217961666.34 1765.31-1.71%1714.52 1978.25 1702.14 QX200比比对测试检测国际标准品，结果显示与标定值一致R20.99样本名称标定值cp/ulFAM平均cp/ulVIC平均cp/ulERM-AD623f101.510.249.85ERM-AD623e1.040.1 x 102102.53109.62ERM-AD623d1.020.09 x 1031021.451045.36ERM-AD623c1.030.1x 10410326.710845.9ERM-AD623b1.080.11x 105118632.5111263.5MicroDrop-20的准确度：检测BCR-ABL 国际标准品ERM-AD623结果R20.99中国计量院新冠测试评比基因检测试剂盒(数字PCR法)人EGFR基因T790M突变检测试剂盒(数字PCR法）人EGFR基因L858R突变检测试剂盒(数字PCR法）人EGFR基因Exon19 del突变检测试剂盒(数字PCR法）BCR/ABL融合基因检测试剂盒(数字PCR法)人HER2基因扩增检测试剂盒(数字PCR法)EB病毒（EBV）核酸检测试剂盒(数字PCR法)MicroDrop数字PCR实测数据数字PCR在临床中的应用ApplicationPARTTHREE无创产前筛查 降低筛查成本，缩短检测周期。适用于T13、T18和T21三体综合征等遗传病风险评估。肿瘤液体活检 突破检测局限，低至万分之一突变检测灵敏度。适用于肿瘤早期筛查、分子分型、靶向用药和疗效监测等。感染性疾病诊断 不依赖标准曲线，轻松实现病原体绝对定量，适用于感染性疾病的早期诊断和治疗指导。临床应用领域l全球约200亿人曾感染HBV，2.4亿人为慢性乙肝感染者，每年有62万人死于HBV感染引起的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌，我国 中国的乙肝患者及携带者高达9300万（携带率7.18%）。每年中国有50万人死于感染HBV后引起的肝功能衰退、肝硬化和肝癌及其并发症.l中国乙型肝炎感染率属全球第一我国疫情我国疫情严严重！重！Case 1 病原微生物的检测-HBV乙肝检测指标作疗效预测的意义乙肝检测指标在诊疗中的应用高灵敏度HBV DNA定量感染早期判断病情监测药物疗效判断用药方案指导停药判断HBV基因分型病情预后发展评估抗病毒药物疗效判断cccDNA检测确定病毒清除判断停药时间判断肝外组织感染乙肝耐药突变检测抗药监测治疗药物选择HBsAg定量检测（全定量）乙肝两对半定量检测疗效预测疗效监测Case 1 病原微生物的检测-HBVPMID:34000391DOI:10.1016/j.ymeth.2021.05.011Case 1 ddPCR平台在HBV-DNA的应用l疗效及复发监测：血清HBV-DNA残留 2.5 copies/mL的患者发生复发的风险更高，通过ddPCR定量残留病毒含量可指导抗病毒治疗方案。l药物研发疗效监测：正在开发几种直接针对HBV复制周期或增强抗HBV免疫反应的药物，其最终目标是实现HBV功能性治愈。高度敏感的血清HBV-DNA定量检测可提依据，以监测这些新药的全部功效。l隐匿性HBV感染患者筛查：体内抗HBc阳性和HBsAg阴性患者的HBV DNA含量低，需要高灵敏的定量，可通过输血或移植进行HBV传播。在预期值和由ddPCR测定值之间观察到线性关系（R 2为0.993），表明测定具有良好的准确性（图 A）。通过ddPCR定量了12名感染了HBV的患者的血清HBV-DNA。其中6例样本，做重复性分析，复孔的差异0.14 log拷贝/mL。平均变异系数（CV）为2.7（对应于绝对值的9.4）（图 B）。另外6例样本，分三次进行实验，三次实验中的样本拷贝数的差异未超过0.21 log拷贝/mL，平均CV为3.4（绝对值相当于14.3）（图 C）。Case 1 ddPCR平台在HBV-DNA的应用在血清HBV-DNA20IU/ml时，qPCR和ddPCR检出率为100%在血清HBV-DNA20IU/ml时，ddPCR检出率为89.8%在qPCR无法检测到HBV-DNA含量的样本中，ddPCR检出率为66.7%，含量为5（49）IU/mL。在远低于qPCR检测限的样本中，ddPCR检出率为40%，含量为1（1-2）IU/mL。Case 1 ddPCR平台在HBV-DNA的应用小结ddPCR通过泊松分布分析显示检测限为4 copies/mL（0.999EBV性能验证线性范围“已有同品种批准上市”产品样本名称理论值LOGCt值Copy/mlQPCR 实测值ddPCR 实测值国际标准品1000.70 Undetermined0.00 0.00 0.00 国际标准品1011.70 Undetermined0.00 0.00 0.00 国际标准品1022.70 Undetermined0.00 0.002.52 国际标准品1033.70 35.11 4812.81 3.68 3.97 国际标准品1044.70 31.78 52296.92 4.72 4.83 国际标准品1055.70 28.95 399283.84 5.60 5.85 国际标准品1066.70 26.54 2259117.926.35 6.56 试剂盒标准品5X10427.06 50000试剂盒标准品5X10523.83 500000试剂盒标准品5X10620.65 5000000试剂盒标准品5X10717.44 50000000数字PCR比已上市QPCR产品灵敏度高一个数量级。EBV性能验证与qPCR对比临床样本检测“已有同品种批准上市”产品比较临临床床样样本本EBV copies/ml对对数数值值 70503010-100.002.004.006.008.00永诺ddPCR华银QPCR临临床床样样本本EBV copies/ml对对数数值值 70503010-100.001.002.003.004.005.006.007.00永诺QPCR永诺ddPCR共检测85例样本，其中15例正常人，不同方法检测均阴性；70例鼻咽癌病人：永诺QPCR:50 of 70 patients EBV DNA positive，71.43%;永诺ddPCR:65 of 70 patients EBV DNA positive，92.86%；某公司QPCR:57 of 70 patients EBV DNA positive，81.43%;EBV临床样本测试临床样本检测-数字PCR已测365例标本，其中正常人76例，NPC初诊病人289例拟进一步分析EBV含量与NPC 诊断、分期、疗效、预后等的关系NPC:264 of 289 patients EBV DNA positive，91.35%;healthy volunteers:none of 76永诺QPCR:194 of 289 patients EBV DNA positive，67.13%;永诺ddPCR:264 of 289 patients EBV DNA positive，91.35%；某医院QPCR:67 of 167 patients EBV DNA positive，59.88%;EBV临床样本测试小结血浆EBV DNA检测作为鼻咽癌早期筛查的常规项目、辅助制定或调整鼻咽癌治疗方案、判断鼻咽癌复发、进展和预后。不同实验室间qPCR缺乏统一标准，检测结果灵敏度低、准确性、重复性差、亟需寻找一种更加灵敏、准确的检测方法。数字PCR技术作为新一代分子检测技术，拥有高灵敏度，准确性以及重复性，完美的解决了上述问题。Source o