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1、新冠核酸检测的质量控制与案例分析新冠核酸检测的质量控制与案例分析2021-10-212021-10-212021-10-212021-10-21内内容容提提要要检验前质量控制检验中质量控制2 2检验后质量控制概 述案例分析1 15 54 43 36 6快检和大规模筛查的准备 2021年4月15日，国家卫生健康委员会发布新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第八版 修订版）的修订要点： 1、明确提出新冠肺炎的诊断原则，即：根据流行病学史、临床表现、实验室检查等进行综合分析，作出诊断。新型冠状病毒核酸检测阳性为确诊的首要标准。未接种新型冠状病毒疫苗者新型冠状病毒特异性抗体检测可作为诊断的参考依据。接种新型
2、冠状病毒疫苗者和既往感染新型冠状病毒者，原则上抗体不作为诊断依据。 2、将“实时荧光 RT-PCR 检测新型冠状病毒核酸检测阳性”与“病毒基因测序与已知的新型冠状病毒同源”两条诊断标准整合为“新型冠状病毒核酸检测阳性”。 3、在疑似病例诊断中，近期接种过新冠病毒疫苗者的相关抗体检测结果不作为参考指标；在确诊病例诊断中，抗体诊断仅适用于“未接种新冠疫苗者”。 4、进一步强调了预防接种对疾病防控的重要性，指出“接种新型冠状病毒疫苗是预防新型冠状病毒感染、降低发病率和重症率的有效手段，符合接种条件者均可接种”。概述概述概述概述 SARS-CoV-2为单股正链RNA病毒，长约30nt(如全长29903
3、 bp,GenBank:MN908947.3)，属于冠状病毒属，有包膜，呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。5端为开放阅读框（open readingframe，ORF)1a和1b，约占基因组全长2/3，编码聚合酶等非结构蛋白；3端约占基因组1/3区域，编码刺突蛋白（spike,S)、小囊膜蛋白（envelope,E)、膜蛋白（membrane,M)和核衣壳蛋白（nucleocapsid，N)。其中，以s区变异最为显著。 病毒通过特定细胞表面受体入侵细胞造成感染，并利用宿主细胞进行复制。病毒核酸检测的原理就是通过细胞裂解液，让病毒的RNA裸露出来，然后用实时荧光逆转录聚合酶链反应
4、（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）进行检测。检测原理最关键的是利用引物和探针来实现核酸序列的“靶向匹配”，即寻找SARS-CoV-2约3万个碱基中区别于其他病毒的核酸序列（与其他病毒核酸相似度“低”的区域），设计引物和探针。引物和探针与SARS-CoV-2核酸特定区域高度匹配，即特异性很强，一但待检样本实时荧光RT-PCR扩增结果为阳性，则证明该样本中存在SARS-CoV-2，引物探针设计主要集中在ORF1ab、E基因、N基因。 新冠肺炎疫情爆发以来，核酸检测成为诊断新型冠状病毒肺炎的主要依据，如何保证检测结果的准确
5、性，需要从标本采集到出具报告的每一个环节，按照流程进行严格的操作，保证检验结果的准确性，避免假阳性、假阴性的产生。 概述概述 新冠病毒核酸检测是COVID-19诊断标准，RT-PCR是最常用的检测方法。影响检测结果影响因素很多，检验前，检验中，检验后质量控制很关键。疫情的迅速控制得益于核酸的快速、大规模早期筛查，及时控制传染源！是发现疫情存在的第一声哨音！是疫情控制是否有效的把关者！是疫情判断所需信息的侦察兵！是新冠肺炎治疗出院的通行证！新型冠状病毒核酸检测 尚未出现尚未出现疫情的地方，要适时开展实战演练，在组织管理、疫情的地方，要适时开展实战演练，在组织管理、指挥调度、采运检匹配、物资供应保
6、障、信息化支撑等全方指挥调度、采运检匹配、物资供应保障、信息化支撑等全方位进行磨合、检验，查找问题和不足，优化全员核酸检测实位进行磨合、检验，查找问题和不足，优化全员核酸检测实施方案。一旦出现疫情，要立即启动应急响应，激活应急指施方案。一旦出现疫情，要立即启动应急响应，激活应急指挥体系。挥体系。确定实施全员核酸检测后，要尽早尽快组织实施全确定实施全员核酸检测后，要尽早尽快组织实施全员核酸检测实施方案，员核酸检测实施方案，确保检测确保检测人数在人数在500万万以内的在以内的在2天内、天内、检测人数大于检测人数大于500万的在万的在3天内完成天内完成全员检测全员检测。四、进一步提高核酸检测能力各地
7、要严格落实进一步推进新冠病毒核酸检测能力建进一步推进新冠病毒核酸检测能力建设设的有关要求，进一步增强辖区内的核酸检测能力建设。要统筹统筹日常核酸检测需求和全员核酸检测需要，对各方核酸对各方核酸检测力量进行有效有序调度检测力量进行有效有序调度，确保开展全员核酸检测时日常“应检尽检、愿检尽检”的检测需求得到保障。要强化核酸检测机构质量控制，按照规定开展室内质控并参加室间质评。要加强人员培训，对全员核酸检测组织管理者、采样人员、包装运输人员、检测人员、报告人员、质控人员、感控人员等在内的所有人员均开展有针对性的培训，特别是使采样、检测人员充分掌握混采检测技术混采检测技术，规范开展采样、检测工作，提高
8、检测质量和检测效率提高检测质量和检测效率，确保检测结果准确可靠，结果报告及时有效。检验前质量控制1、实验室资质、环境及设施2、人员资质与培训3、仪器设备与管理4、检测方法性能验证5、试剂耗材质检6、样本采集、运输及保存检验中质量控制1、人员操作、核酸提取、 扩增及产物处理2、室内质量控制3、室间质量评价4、失控处理及原因分析5、实验室清洁工作检验后质量控制1、结果的分析2、结果报告与解释实验全过程质量控制01 检验前质量控制检验前质量控制 实验室资质要求 应当符合病原微生物实验室生物安全管理条例（国务院令第424号）和 医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法（卫办医政发2010194 号）有关
9、规定 具备经过卫生健康行政部门审核备案的生物安全二级及以上实验室条件，以及临床基因扩增检验实验室条件。 独立设置的医学检验实验室还应当符合医学检验实验室基本标准（试行） 医学检验实验室管理规范（试行）等要求。检验前检验前质量控制质量控制实 验 室 资 质 新冠核酸检测实验室按功能区布置位置的不同， 可分为集中布置形式和分散布置形式。 试剂储存区：试剂贮存、分装、配置 标本制备区：标本灭活、核酸提取及加样 扩 增 区 ：核酸扩增 产物分析区：结果分析 如采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，标本制备区、扩增和产物分析区可合并。检验前检验前质量控制质量控制实 验 室 分 区应遵循原
10、则：各区独立 单向流动（注意风向，压力梯度走向） 因地制宜 方便工作检验前检验前质量控制质量控制实 验 室 分 区时刻关注行业发展持续学习先进技术岗位胜任力不断提升外部培训人员轮岗学习 熟练操作技术攻破薄弱环节内部培训 大专或中级以上，两年以上实验室工作经历，取得临床基因扩增检验培训合格证书。持证上岗检验前检验前质量控制质量控制人员资质与培训检验前检验前质量控制质量控制仪器设备与管理仪器定期校准、日常维护 正确使用、表格记录检验前检验前质量控制质量控制试剂、方法性能验证在用于临床标本检测前，实验室应对核酸提取试剂、扩增试剂、提取仪、扩增仪等进行必要的性能验证，性能指标包括但不限于精密度、最低检
11、测限。建议选用高灵敏的试剂（检测限500拷贝/ml）试剂试剂说明书说明书 按要求采集样本，所有标本应当放合格采样管中，拧紧，密封。容器外有明确患者信息标注。 标本采集后应在2-4h内送到实验室。长途运输标本，应采用干冰等制冷方式包装运输。 标本接收人员的个人防护按采样人员防护装备执行，并进行双签收。 24小时内无法检测的标本则应置于-70或以下保存（如无-70保存条件，则于-20冰箱暂存）。境外高风险区域人群以及新冠肺炎患者的密接者和密接者的密接者等集中隔离人员的核酸检测标本，检测后，应当在-20保存7天。其他一般人群筛查标本，则可在-4保存24小时。应当设立专库或专柜单独保存标本。标本运送期
12、间避免反复冻融。检验前检验前质量控制质量控制样本采集、运输及保存 目前应用最广泛的呼吸道样本，如鼻咽拭子等均采用灭活采样液即以核酸提取裂解液为基础配制的灭活（保存）液。这种病毒保存液可让病毒的蛋白变性，失去活性，不再有传染性，提高运输和检测阶段的安全性。还有一种直接裂解病毒释放核酸，以核酸提取裂解液为基础配制的病毒采样液，主要成分为平衡盐类、乙二胺四乙酸螯合剂、胍盐（异硫氰酸胍、盐酸胍等）、阴离子表面活性剂（十二烷基硫酸钠）、阳离子表面活性剂（十四烷基三甲基草酸铵）、苯酚、8-羟基喹啉、二硫苏糖醇、蛋白酶K等几种或多种组分。检验前质量控制检验前质量控制02 检验中质量检验中质量控制控制检验中检
13、验中质量控制质量控制样本处理过程 一、试剂配制时，须在试剂准备间生物安全柜或超净工作台内配置；试剂盒阴、阳对照要提前取出放置在核酸提取间，待全部待测样本加样完毕并封装好后再取出。 二、核酸提取时，在生物安全柜内用带滤芯的吸头吸取标本， 移液器切勿插进管内。 三、 核酸加样时，先加样本核酸和阴性对照试剂， 封膜或盖管，最后加阳性对照，确保反应管密封后离心、上机。 一旦出现污染，立即停止所有实验，所有参与本次实验过程中的耗材和实验全部扔掉，实验室彻底消毒。检测合格后方可重新开始实验。检验中质量控制检验中质量控制室内质控品质控品应与所有标本同时检测。至少一个弱阳性质控和三个阴性质控样本（可有一个HS
14、C),随机放在临床标本中间，参与从提取到扩增检测全过程PTC(阳性对照）有预期Ct值范围的阳性模板对照。NTC(阴性对照）在RT-PCR反应开始时加入阴性模板对照。HSC-与待测标本同时提取的人类标本质控品；提供核酸提取程序质控和辅助阴性质控以验证核酸提取程序和试剂的完整性。RP-检测所有临床标本中的人类RNase P基因（含一条375碱基的单链RNA分子）以评估标本质量。注意：在每次检测后，记录弱阳性质控品检测的Ct值。检验中检验中质量控制质量控制室内质量控制 若发生质控品结果与预期结果不同，则视为失控。 （阳性质控未检出，阴性质控出现阳性曲线，内标不起等）阳性结果不可发，查找原因，重做所有
15、的阳性样本，增加一倍阴性质控样本；阴性结果根据阳性质控的结果决定是否发出；分析当天检测人员与平常是否有差异，明确是否有潜在污染发生，是否是假失控。分析仪器及试剂是否发生污染，或样本间交叉污染。分析样本中是否存在核酸检测抑制干扰物，或取样不合格等标本问题。检验中检验中质量控制质量控制失控原因及处理核酸检测的质量保证核酸检测的质量保证检测质控品检测质控品质控品应与所有标本同时检测，至少质控品应与所有标本同时检测，至少一个弱阳性质控和三个阴性质一个弱阳性质控和三个阴性质控样本控样本随机放在临床标本中间，参与从提取到扩增检验全过程。随机放在临床标本中间，参与从提取到扩增检验全过程。弱阳性质控品应为弱阳
16、性质控品应为1.53倍检测限！倍检测限！核酸检测可以作为病毒感染诊断的核酸检测可以作为病毒感染诊断的“金标准金标准”当然有当然有可能，其可能，其最主要的原因：最主要的原因：标本（包括试剂盒所带的强阳性对照）之间的标本（包括试剂盒所带的强阳性对照）之间的“交叉污染交叉污染”扩增产物的扩增产物的“遗留污染遗留污染”其他可能的原因：其他可能的原因：试剂污染试剂污染某种偶然误差如加错样本所致某种偶然误差如加错样本所致疫苗疫苗及时观察样本检测整体及时观察样本检测整体情况，如果出现阳性结情况，如果出现阳性结果偏多，尤其是出现较果偏多，尤其是出现较多单靶阳性或弱阳性结多单靶阳性或弱阳性结果，则很有可能污染的果，则很有可能污染的存在！存在！假阴性1.被感染者的细胞中有一定量的病毒：一个特定的疑似感染的患者，不同的病期，在不同的身体部位出现病毒的浓度会有差异，如咽部没有，却可能粪便中有，如能同时或在疾病过程中的不同时间采取上述多种标本进行检测，会有助于“假阴性”的避免。2.标本采集时要采集到含有病毒的细胞：理论上说，目前的注册试剂都包含检测人细胞的序列“内标”，如含有一个单链RNA分子的RNase P。
