研究感染性骨缺损大鼠骨生长因子在骨搬移治疗中的表达情况文题释义：感染性骨缺损：多由高能量损伤引起并伴有感染性病变的骨缺损，若治疗不及时或处理不当会出现肢体功能障碍和败血症等一系列严重的并发症骨搬移：应用张力-应力法则，通过外固定架向组织施加牵拉力来促进骨、软组织及神经的生长并加速周围血液循环以达到控制感染、促进损伤修复的目的引言随着社会的发展，开放性以及高能量性的损伤逐年增多，从而致使临床上骨损伤、软组织损伤以及粉碎性骨折等疾病也有所增加骨缺损类疾病常因处理不及时或处理不善而诱发感染性骨缺损的发生，由于感染性骨缺损存在骨缺损和感染的双重病变，极易引起肢体功能性障碍、败血症等一系列严重的并发症，在临床治疗上较为棘手[1,2,3]就目前医疗水平而言，感染性骨缺损不仅是国内骨科医生面临的挑战，也是世界同行面临的难题之一近年来，有研究表明骨愈合是在多种生长因子参与下完成修复、再生与重建的病理生理性过程其中碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)和胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactors-1,IGF-1)在骨愈合的过程中发挥重要作用。
碱性成纤维细胞生长因子是一类具有广泛生物活性的细胞生长因子，属广谱性有丝分裂原，可促进神经细胞生长，诱发毛细血管生成，同时也具有促进创伤愈合、组织再生修复功能的特性[4,5]胰岛素样生长因子1为胰岛素同源多肽，主要分布于骨细胞中，可调控成骨细胞，促进骨基质的合成与矿化并参与骨折愈合与骨重建[6,7]此次研究旨在通过建立大鼠感染性骨缺损模型，检测胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子2种骨生长因子在大鼠感染性骨缺损术前术后的表达情况，为今后感染性骨缺损的临床治疗及预后提供可靠性生物学指标，进而为感染性骨缺损的临床治疗提供新思路1、材料和方法1.1设计随机对照动物实验1.2时间及地点于2018年1月至2019年8月在广西医科大学实验中心完成1.3材料1.3.1实验主要试剂与仪器大鼠胰岛素样生长因子1(IGF-1)ELISAKit、大鼠碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)ELISAKit(武汉基因美生物科技有限公司)；手术器械(上海医疗器械有限公司)，脱水机(型号ExcelsiorAS)、包埋机(型号HistoStar)(ThermoFisher公司，美国)；切片机(型号RM2245)、组织切片染色机(型号ST5010)(Leica公司，德国)双目显微镜，(型号BX53,Olympus公司，日本)。
1.3.2实验动物选用SPF级成年雄性SD大鼠36只，体质量200-250g，购自广西医科大学动物实验中心，实验许可证号：SYXK桂2014-0003所有动物操作程序均根据国家相关实验动物使用准则施行，并获得广西医科大学动物使用伦理委员会的批准1.4实验方法1.4.1制备实验动物模型将36只大鼠置于SPF级环境适应性饲养1周，术前8h禁食禁水称质量后给予3%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射待完全麻醉后，仰卧位固定四肢，手术区常规备皮消毒，铺无菌洞巾，依次切开皮肤和皮下组织，仔细分离肌肉，用骨膜剥离器仔细剥离骨膜后用骨钻在胫骨下端制成长约4mm大小的骨缺损，在缺损部位注射1×104CFU金黄色葡萄球菌，术后不使用抗生素1.4.2动物分组造模2周后将感染性骨缺损造模成功的36只大鼠随机分为手术组和对照组，每组18只对照组用生理盐水、双氧水反复清洗创面，刮除炎性肉芽及坏死组织并安装支架，安装支架后不进行搬移手术组用生理盐水、双氧水反复清洗创面，刮除炎性肉芽及坏死组织后安装支架待静息期7d后在胫骨上端进行搬移，每天搬移0.5mm，每天分2次进行，共搬移14d在安装支架后给所有大鼠连续肌注青霉素3d预防感染。
对于术中术后死亡的动物给予及时补充1.5主要观察指标1.5.1大体观察观察大鼠感染性骨缺损模型建立后及手术后的生命体征、精神、进食状况以及伤口情况1.5.2X射线片观察于安装支架后2周拍摄各组大鼠胫骨X射线片，通过影像学观察骨缺损部位愈合及情况，新生骨及骨痂形成情况1.5.3组织病理学观察于安装支架后的第2,3,4周分批麻醉后处死动物，取骨缺损断端为中心的骨组织，依次进行固定、脱钙、脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红染色、脱水、透明、封固后将其置于低倍镜下(×100)分别观察新骨生长、血管新生、成骨细胞、骨小梁以及胶原纤维等生成的情况1.5.4Elisa检测血清胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子表达分别于安装支架后2,3,4周麻醉处死动物，腹腔取血静置30min后，2500r/min、4℃离心，分离血清并置于-80℃环境下保存，采用酶联免疫吸附法检测大鼠血清胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子水平1.6统计学分析采用SPSS24.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义2、结果2.1实验动物数量分析实验选用大鼠36只，分为2组，实验过程死亡2只，给予补充，36只进入结果分析。
2.2造模情况36只大鼠在感染性骨缺损造模后的第1天出现饮食减少，精神状态差，伤口出现局部红肿并有黏稠液体流出，活动明显受限等症状；造模后第2天有2只大鼠死亡，后期进行补充；1周后36只大鼠生命体征平稳，可正常饮食，活动自由，精神尚可安装支架后，2组大鼠第1天精神食欲欠佳，活动受限，3d后逐渐恢复正常饮食及活动，造模情况，见图12.3X射线片检查结果安装支架后2周X射线片显示：手术组可见骨缺损区形成高密度骨痂，周围软组织未见明显肿胀，骨小梁排列较为整齐；对照组的骨缺损间隙仍清晰可见，未见明显缩窄，骨痂少且密度低，未见骨小梁，见图22.4苏木精-伊红染色结果苏木精-伊红切片结果显示，第2周手术组的纤维组织减少，可见较多成骨细胞，骨小梁趋于致密；对照组可见大量排列紧密的条索状纤维结缔组织，骨小梁大小不一形态不规则第3周手术组可见较多间充质细胞和新生毛细血管，骨小梁结构致密；对照组可见成软骨细胞，间充质细胞及少许新生毛细血管，骨小梁排列紊乱第4周手术组成骨细胞、骨细胞密集，骨小梁由密集的成骨细胞环绕，可见大量类骨质组织；对照组成骨细胞，骨细胞较少，有少量破骨细胞分布，可见较多类骨质组织，见图3。
2.5胰岛素样生长因子1与碱性成纤维细胞生长因子表达水平通过对Elisa结果统计分析发现，在第2,3,4周手术组胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子表达量均高于对照组，其中手术组胰岛素样生长因子1的表达量，在第2,3周与对照组相比差异有显著性意义(P<0.05)，第4周差异无显著性意义(P>0.05)手术组碱性成纤维细胞生长因子在第2周的表达量显著高于对照组(P<0.05)，第3,4周差异无显著性意义(P>0.05)，见表1，图4表1两组胰岛素样生长因子1与碱性成纤维细胞生长因子表达情况(±s,n=6,ng/L)3、讨论此次实验通过建立大鼠感染性骨缺损模型不仅可以观察到病变的整个过程，还可以对其治疗方法进行分析，对日后临床感染性骨缺损的治疗具有重要意义感染性骨缺损大鼠模型的建立在细菌种类的选择上主要有4种，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和混合细菌[8]由于临床上感染性骨缺损以金黄色葡萄球菌多见[9]，故实验在模型建立过程中选用浓度为1×104CFU金黄色葡萄球菌直接置于入创面[10]，敞开创面并静置1h后缝合以此来模仿开放性骨折的感染机制[11]，构建感染骨缺损模型图1手术组大鼠骨搬移造模图图2两组大鼠造模后第2周骨缺损区(箭头所指)X射线图片图3两组术后骨组织苏木精-伊红染色情况(×100)图4两组胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子表达量比较目前临床上治疗感染性骨缺损的方法主要有6种，分别为骨清创术、骨搬移技术、骨移植、抗生素复合缓释载体移植、Masquelet技术以及骨组织工程[12]。
有研究表明，骨搬移技术是临床上治疗感染性骨缺损的金标准[13]，该方法通过外固定架缓慢牵拉刺激周围组织，其牵张力的实施是促进组织修复愈合的关键[14,15,16]不仅促进骨、软组织及神经血管的生长，还可以促进周围组织的血液循环该方法不仅有助于畸形矫正、组织缺损的修复，还可以抑制炎症因子控制感染但由于目前通过实施骨搬移手术治疗大鼠感染性骨缺损并研究骨生长因子表达情况的报道尚少，因此此次研究采用此方法，探究胰岛素样生长因子1与碱性成纤维细胞生长因子2种骨生长因子的表达情况，为进一步研究骨生长因子在感染性骨缺损愈合过程中的作用及机制打下基础近年来，研究发现骨愈合的过程与成骨细胞活性、周围血运、激素及骨生长因子密切相关[17]国内外学者发现骨生长因子在牵拉成骨过程中对骨愈合及骨重建起到了至关重要的作用[18]，其中胰岛素样生长因子1是由70个氨基酸组成的一类单链多肽性物质，在个体的生长发育及细胞增殖分化方面具有积极作用[19,20]，现如今其已被证实可促进体内外成骨[21]其可诱导成骨细胞分化和矿化，促进成骨细胞分裂抑制成骨细胞凋亡，有助于骨小梁的重建[22]有研究用Ⅰ型胶原凝胶增强胰岛素样生长因子1去修复大鼠面部骨缺损，发现胰岛素样生长因子1组骨密度和厚度有所增加，证实胰岛素样生长因子1可加快骨缺损的愈合[23]。
MEINEL等[24]用聚乳酸微球释放系统治疗绵羊长骨骨缺损，证实胰岛素样生长因子1可降低骨损伤部位炎性标志物表达，诱导新生骨形成减少骨吸收碱性成纤维细胞生长因子是由氨基酸残基组成的碱性多肽，通过自分泌和旁分泌方式促进细胞分裂增殖，增加血管的通透性及血管生成[25,26]；通过激活丝裂原活化蛋白激酶信号通路促进成骨细胞的增殖迁移，有助于骨与软组织、软骨及神经组织损伤修复[27,28]CANALIS等[29]在碱性成纤维细胞生长因子对大鼠颅骨骨形成的研究中，证实碱性成纤维细胞生长因子可刺激颅骨DNA合成并促进胶原合成细胞数量增加李辉等[30]用碱性成纤维细胞生长因子生物蛋白海绵治疗骨缺损型骨折，证实其可促进骨缺损型骨折的愈合，提高愈合率，减少骨折延迟愈合、骨不连及再手术植骨的发生，且无明显不良反应发生此次研究在大鼠感染性骨缺损造模后实施骨搬移手术治疗，通过苏木精-伊红染色结果发现手术组的骨小梁密度较对照组致密排列整齐规律，成骨细胞也有所增多结合X射线片结果，进一步证实了手术组骨痂更为致密，愈合更好的情况在此基础上，通过Elisa进一步探究其分子机制，结果显示术后手术组胰岛素样生长因子1表达上调，2-4周胰岛素样生长因子1的表达量均高于对照组并于第2周时达到高峰，而后随时间推移表达量逐渐降低，并在第2,3周与对照组间存在显著性差异(P<0.05)；碱性成纤维细胞生长因子表达量与对照组相比显著增加，2-4周碱性成纤维细胞生长因子的表达量均高于对照组并于第3周达到峰值，第2周与对照组之间存在显著性差异(P<0.05)。
已有研究指出骨骼肌状态的不同，其相关生长因子分泌情况也会有所不同[31]此次研究结果发现在手术后的第2周胰岛素样生长因子1以及碱性成纤维细胞生长因子显著上调，可能是由于机体受到牵张应力作用从而刺激了相关骨生长因子的分泌一些学者认为碱性成纤维细胞生长因子其生物学效应与成骨细胞的分化程度以及骨吸收相关，胰岛素样生长因子1的调节系统与成骨和破骨细胞的活动有关，所以在牵张早期骨愈合需要大量蛋白的时期2种骨生长因子分泌增多，而随着时间的推移停止了牵张刺激并且骨损伤修复状态有所改变，骨痂及周围组织的增加致使碱性成纤维细胞生长因子以及胰岛素样生长因子1释放减少这也进一步说明胰岛素样生长因子1以及碱性成纤维细胞生。