饲料中辣椒红的测定高效液饲料中辣椒红的测定高效液相色谱法相色谱法+饲料中维生素饲料中维生素 D D3 3的测定高效液相色谱法的测定高效液相色谱法2025 年 9 月饲料中辣椒红的测定 高效液相色谱法 警示 使用本文件的人员应有正规实验室工作的实践经验本文件并未指出所有可能的安全问题,使用者有责任采取适当的安全和健康措施,并保证符合国家有关规定的条件1 范围 本文件描述了饲料中辣椒红的高效液相色谱测定方法本文件适用于配合饲料、浓缩饲料和维生素预混合饲料中辣椒红(以辣椒红素和辣椒玉红素之和计)的测定本文件中辣椒红素和辣椒玉红素的检出限均为0.0 5m g/k g,定量限均为0.1m g/k g2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T2 0 1 9 5 动物饲料 试样的制备3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义4 原理试样中辣椒红素和辣椒玉红素经乙腈提取,高效液相色谱仪测定,外标法定量。
5 试剂或材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂5.1 水:G B/T6 6 8 2,一级5.2 乙腈:色谱纯5.3 磷酸溶液(0.3%,体积分数):移取1.5m L磷酸,用水稀释至5 0 0m L,混匀5.4 辣椒红素和辣椒玉红素标准储备溶液(1 0 0g/m L):称取辣椒红素(C A S号:4 6 5-4 2-9,纯度9 5%)和辣椒玉红素(C A S号:4 7 0-3 8-2,纯度9 5%)标准品各1 0 m g(精确至0.0 1 m g),分别置于1 0 0m L棕色容量瓶中,用乙腈(5.2)溶解、定容,混匀28保存,有效期1个月5.5 混合标准中间溶液(1 0g/m L):分别准确移取1m L辣椒红素和辣椒玉红素标准储备溶液(5.4)于1 0m L棕色容量瓶中,用乙腈(5.2)稀释、定容,混匀临用现配5.6 混合标准系列溶液:准确移取适量混合标准中间溶液(5.5)于1 0m L棕色容量瓶中,用乙腈(5.2)稀释、定容,混匀,配制成质量浓度分别为0.0 2g/m L、0.1g/m L、0.5g/m L、1g/m L、2g/m L和1G B/T4 5 2 0 82 0 2 55g/m L混合标准系列溶液。
临用现配5.7 微孔滤膜:0.4 5m,有机系6 仪器设备6.1 高效液相色谱仪:配紫外检测器或二极管阵列检测器6.2 分析天平:精度1m g和0.0 1m g6.3 涡旋混合器6.4 离心机:转速不低于50 0 0r/m i n7 样品按照G B/T2 0 1 9 5规定制备试样,至少2 0 0g,粉碎使其全部过0.4 2 5mm试验筛,混合均匀,装入密闭容器中,避光保存,备用8 试验步骤8.1 提取平行做两份试验称取5g(精确至1m g)试样于5 0m L离心管中,准确加入2 5m L乙腈(5.2),涡旋振荡1 0m i n(如黏稠,可加搅拌子进行均质),于50 0 0r/m i n离心5m i n取适量上清液,过微孔滤膜(5.7),滤液待测8.2 液相色谱参考条件液相色谱参考条件如下a)色谱柱:C8柱,柱长1 0 0mm,内径3.0mm,粒径2.7m,或性能相当者b)柱温:3 5c)流速:0.5m L/m i nd)检测波长:4 7 5n me)进样体积:5Lf)流动相:A相为乙腈(5.2),B相为0.3%磷酸溶液(5.3),梯度洗脱程序见表1表1 梯度洗脱程序时间/m i nA相/%B相/%0.0 07 52 51.0 01 0 006.0 01 0 006.1 07 52 51 2.0 07 52 52G B/T4 5 2 0 82 0 2 58.3 测定8.3.1 标准系列溶液和试样溶液测定在仪器的最佳条件下,分别取混合标准系列溶液(5.6)和试样提取溶液(8.1)上机测定。
辣椒红素和辣椒玉红素标准溶液的液相色谱图见附录A8.3.2 定性以保留时间定性,试样溶液中辣椒红素和辣椒玉红素保留时间应与标准系列溶液(质量浓度相当)中辣椒红素和辣椒玉红素的保留时间一致,其相对偏差在2.5%之内8.3.3 定量以辣椒红素和辣椒玉红素的质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,其相关系数应不低于0.9 9试样溶液中待测物的质量浓度应在标准曲线的线性范围内如超出范围,应将试样溶液用乙腈(5.2)稀释后重新测定单点校准定量时,试样溶液中待测物的质量浓度与标准溶液质量浓度相差不超过3 0%9 试验数据处理试样中辣椒红素和辣椒玉红素的含量wi以质量分数计,数值以毫克每千克(m g/k g)表示多点校准按式(1)计算,单点校准按式(2)计算wi=iVf10 0 0m10 0 0(1)式中:i 从标准曲线查得的试样溶液中辣椒红素或辣椒玉红素的质量浓度,单位为微克每毫升(g/m L);V 试样提取溶液体积,单位为毫升(m L);f 试样溶液稀释倍数;10 0 0 换算系数;m 试样质量,单位为克(g)wi=AisiVf10 0 0Asim10 0 0(2)式中:Ai 试样溶液中辣椒红素或辣椒玉红素色谱峰面积;si 标准溶液中辣椒红素或辣椒玉红素的质量浓度,单位为微克每毫升(g/m L);V 试样提取溶液的体积,单位为毫升(m L);f 试样溶液稀释倍数;10 0 0 换算系数;Asi 标准溶液中辣椒红素或辣椒玉红素色谱峰面积;m 试样质量,单位为克(g)。
试样中辣椒红的含量w以质量分数计,数值以毫克每千克(m g/k g)表示,按式(3)计算w=w1+w2(3)式中:w1 辣椒红素含量,单位为毫克每千克(m g/k g);3G B/T4 5 2 0 82 0 2 5w2 辣椒玉红素含量,单位为毫克每千克(m g/k g)测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字1 0 精密度在重复性条件下,两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的1 0%4G B/T4 5 2 0 82 0 2 5附 录 A(资料性)辣椒红素和辣椒玉红素标准溶液液相色谱图 辣椒红素和辣椒玉红素标准溶液的液相色谱图见图A.1标准序号说明:1 辣椒玉红素;2 辣椒红素图A.1 辣椒红素和辣椒玉红素标准溶液(1 g/m L)液相色谱图5G B/T4 5 2 0 82 0 2 5饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法1 范围本文件描述了饲料中维生素D3的高效液相色谱测定方法本文件中“第一法 皂化提取法”适用于配合饲料、精料补充料、浓缩饲料、复合预混合饲料中维生素D3的测定,“第二法 直接提取法”适用于维生素预混合饲料中维生素D3的测定本文件第一法定量限为1 0 0I U/k g,第二法定量限为2.0 01 05I U/k g。
2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件G B/T6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T2 0 1 9 5 动物饲料 试样的制备3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义4 第一法 皂化提取法注意:分液漏斗活塞玻璃表面不涂油,处理过程在避光下操作;提取过程在通风柜中操作4.1 原理试样用氢氧化钾乙醇溶液皂化,经液液萃取或固相萃取净化、浓缩后,用二维色谱系统分离,紫外检测器检测,外标法定量复合预混合饲料也可直接用反相色谱柱分离,紫外检测器检测,外标法定量4.2 试剂或材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂4.2.1 水:G B/T6 6 8 2,一级4.2.2 无水乙醇:色谱纯4.2.3 无水乙醇4.2.4 石油醚(沸程3 06 0)4.2.5 甲醇:色谱纯4.2.6 乙腈:色谱纯4.2.7 甲酸:色谱纯4.2.8 异丙醇:色谱纯1G B/T1 7 8 1 82 0 2 54.2.9 L-抗坏血酸4.2.1 0 二丁基羟基甲苯(B HT)。
4.2.1 1 无水硫酸钠4.2.1 2 氢氧化钾溶液(5 0 0g/L):称取5 0 0g氢氧化钾,加水溶解,冷却后用水定容至1L,混匀4.2.1 3 乙醇溶液(7 0%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)7 0 0m L,用水稀释,定容至1L,混匀4.2.1 4 乙醇溶液(5 0%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)5 0 0m L,用水稀释,定容至1L,混匀4.2.1 5 甲醇溶液(1 0%,体积分数):量取甲醇1 0m L,用水稀释,定容至1 0 0m L,混匀4.2.1 6 甲酸溶液(0.1%,体积分数):量取甲酸1m L,用水稀释,定容至1L,混匀4.2.1 7 乙醇溶液(4 0%,体积分数):量取无水乙醇(4.2.3)4 0 0m L,用水稀释,定容至1L,混匀4.2.1 8 乙腈-异丙醇混合溶液:量取5 0m L乙腈(4.2.6)与5 0m L异丙醇(4.2.8)混合均匀4.2.1 9 维生素D3标准储备液(4 00 0 0I U/m L):称取5 0m g维生素D3(胆钙化醇)标准品(C2 7H4 4O,C A S号:6 7-9 7-0,纯度9 9.0%,或标准物质/标准样品)(精确至0.0 0 00 1g)于5 0m L棕色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)溶解并稀释至刻度,混匀,-2 0-1 8避光保存,有效期为6个月。
注:1国际单位(I U)维生素D3相当于0.0 2 5g胆钙化醇4.2.2 0 维生素D3标准中间溶液(10 0 0I U/m L):准确移取维生素D3标准储备液(4.2.1 9)0.2 5m L于1 0m L棕色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)稀释定容,混匀,临用现配4.2.2 1 维生素D3标准系列溶液:准确吸取适量的维生素D3标准中间溶液(4.2.2 0),于1 0 0m L棕色容量瓶中,用无水乙醇(4.2.2)稀释并定容,混匀,配制成质量浓度分别为0.0 5I U/m L、0.1I U/m L、0.2I U/m L、0.5I U/m L、1.0I U/m L、5.0I U/m L、1 0.0I U/m L、2 0.0I U/m L及5.0I U/m L、1 0.0I U/m L、2 0.0I U/m L、5 0.0I U/m L、1 0 0.0I U/m L标准系列溶液,临用现配4.2.2 2 维生素D3标准系列溶液:准确吸取适量的维生素D3标准中间溶液(4.2.2 0),于1 0 0m L棕色容量瓶 中,用 乙 醇 溶 液(4.2.1 4)稀 释 并 定 容,混 匀,配 制 成 质 量 浓 度 分 别 为0.0 6I U/m L、0.1 2I U/m L、0.2 4I U/m L、0.4I U/m L、0.8 0I U/m L、1.6I U/m L、4.0I U/m L、8.0I U/m L、1 6I U/m L标准系列溶液,临用现配。
4.2.2 3 酚酞指示剂(1 0g/L):称取1g酚酞,用9 5%乙醇溶解,并稀释至1 0 0m L,混匀4.2.2 4 固相萃取柱:填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物,2 0 0m g/6m L,或相当者4.2.2 5 固相萃取柱:填料为聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物,长为1 2.5mm,内径为4.6mm,粒径为1 5m2 0m,或相当者4.2.2 6 微孔滤膜:孔径0.2m,有机系4.2.2 7 氮气:纯度9 9.9%4.3 仪器和设备4.3.1 高效液相色谱仪:配有紫外吸收检测器(或二极管矩阵检测器)4.3.2 二维液相色谱系统:配有1个紫外检测器(或二极管矩阵检测器)和1个高灵敏度紫外检测器(或二极管矩阵检测器)4.3.3 固相萃取-二。