化学品鱼类细胞系急性毒性化学品鱼类细胞系急性毒性虹鳟鳃细胞系（虹鳟鳃细胞系（RTgill-W1RTgill-W1）试验试验+蜂王浆及蜂王浆冻干蜂王浆及蜂王浆冻干粉中羟甲基糠醛含量的测定粉中羟甲基糠醛含量的测定高效液相色谱法高效液相色谱法2025 年 9 月化学品 鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃细胞系(R T g i l l-W 1)试验1 范围本文件描述了化学品鱼类细胞系急性毒性 虹鳟鳃细胞系(R T g i l l-W 1)试验方法本文件适用于测试和评价化学品对鱼类细胞系的急性毒性2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件G B/T2 1 8 5 2 化学品 分配系数(正辛醇-水)高效液相色谱法试验G B/T2 1 8 5 3 化学品 分配系数(正辛醇-水)摇瓶法试验G B/T2 2 0 5 2 用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力和温度关系及初始分解温度的方法G B/T2 2 2 2 8 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在1 0-1P a至1 05P a范围内的测定 静态法G B/T2 2 2 2 9 工业用化学品 固体及液体的蒸气压在1 0-3P a至1P a范围内的测定 蒸气压平衡法G B/T2 7 8 6 0 化学品 高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数G B/T4 2 4 2 6 化学品 蒸气压试验3 术语和定义、缩略语3.1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1 细胞活力 c e l l v i a b i l i t y处于健康状态(即代谢活跃,细胞膜和细胞器完好)的细胞百分比3.1.2 效应浓度 e f f e c t c o n c e n t r a t i o n;E Cx在给定试验周期内,与阴性对照或溶剂对照相比,引起细胞活力x%变化的受试物的浓度3.1.3 L-1 5完全培养基 L-1 5c o m p l e t e c u l t u r em e d i u mL e i b o v i t zL-1 5培养基中添加5%胎牛血清和可选抗生素注:常用的抗生素有0.5%庆大霉素3.1.4 L-1 5/e x培养基 L-1 5/e xm e d i u m无蛋白培养基,含有与L e i b o v i t zL-1 5培养基相同的盐、半乳糖和丙酮酸注:用于细胞暴露试验1G B/T4 6 1 4 42 0 2 53.1.5 半数致死浓度 m e d i a nl e t h a l c o n c e n t r a t i o n;L C5 0在给定试验周期内,导致5 0%受试生物死亡的受试物浓度3.1.6 最低可观察效应浓度 l o w e s t o b s e r v e de f f e c t c o n c e n t r a t i o n;L O E C在给定试验周期内,与对照组相比,在统计学意义上对受试物产生显著效应(p小于0.0 5)的最低受试物浓度。
3.1.7 无可观察效应浓度 n oo b s e r v e de f f e c t c o n c e n t r a t i o n;N O E C在给定试验周期内,与对照组相比,在统计学意义上对受试物未产生显著效应(p大于或等于0.0 5)的最高受试物浓度3.2 缩略语下列缩略语适用于本文件C F D A-AM:5-羧基荧光素二乙酸乙酰毒性甲酯(5-c a r b o x y f l u o r e s c e i nd i a c e t a t ea c e t o x y m e t h y le s t e r)DM S O:二甲基亚砜(D i m e t h y lS u l f o x i d e)F B S:胎牛血清(F e t a lB o v i n eS e r u m)P B S:磷酸盐缓冲液(P h o s p h a t eB u f f e r e dS a l i n e)3,4-D C A:3,4-二氯苯胺(3,4-D i c h l o r o a n i l i n e)4 试验原理采用特别设计的无蛋白培养基(L-1 5/e x培养基)在2 4孔板中培养融合单层的R T g i l l-W 1细胞,在黑暗环境中暴露于受试物中2 4h。
针对同一组细胞,采用三种不同的荧光指示染料检测细胞活力以表明细胞毒性三种染料包括:基于刃天青的染料用于评估细胞代谢活性;C F D A-AM用于评估细胞膜的完整性;中性红用于评估溶酶体膜的完整性通过测定上述染料在培养基中的荧光来评估细胞活力在暴露开始(0h)和结束(2 4h)时对培养板孔中的暴露培养基进行浓度分析,以确定受试物实测浓度的几何平均值结果以受试物浓度组相对未暴露的对照组中细胞活力的百分比来表示由此得到的浓度-效应曲线用于确定导致细胞活力损失5 0%的效应浓度,即E C5 0值也可获得其他效应参数,如由非线性回归得到的无毒浓度,或由假设检验(方差分析)得到的L O E C或NO E C5 受试物信息受试物信息包括:a)结构式;b)分子量;c)纯度;d)在试验条件下的稳定性;e)水中解离常数(pKa),具体方法见参考文献3;f)按照G B/T2 7 8 6 0测定的有机碳分配系数(Ko c),也可用其他方法测定的结果,见参考文献2;g)按照G B/T2 1 8 5 2或G B/T2 1 8 5 3方法测定的正辛醇/水分配系数(Po w);h)按照G B/T2 2 0 5 2、G B/T2 2 2 2 8、G B/T2 2 2 2 9、G B/T4 2 4 2 6方法测定的蒸气压,并计算亨利常2G B/T4 6 1 4 42 0 2 5数,预测受试物挥发可能造成的损失;i)分析方法及相关参数(如准确度、精密度、检测限、定量限、特异性和线性范围)。
6 参比物在开展常规试验之前,应以3,4-二氯苯胺(3,4-D C A)为参比物,至少独立重复3次全浓度范围的试验,以表明实验室具备相关技术能力并检查R T g i l l-W 1细胞系的敏感性7 试验准备7.1 仪器设备7.1.1 生物安全柜7.1.2 培养箱7.1.3 显微镜7.1.4 真空泵7.1.5 荧光分析仪7.1.6 离心机7.1.7 细胞计数器7.1.8 细胞培养瓶7.1.9 2 4孔板7.2 试剂按照附录A的方法配制用于细胞培养的L-1 5完全培养基和用于试验的L-1 5/e x培养基7.3 细胞系7.3.1 细胞系的培养和传代R T g i l l-W 1细胞系于1 91的条件下在细胞培养瓶中贴壁生长,不需要提供额外的二氧化碳或蒸汽当细胞达到9 0%1 0 0%的融合度时,进行传代每1 0d1 2d进行一次传代,通常以12的比例进行细胞经传1 5 0代后应被弃用,解冻传代数较低的新细胞进行培养细胞系的培养、传代和冻存方法见附录B7.3.2 试验细胞的准备从培养瓶中收集约11 07个R T g i l l-W 1细胞,除了无细胞对照以外,每孔接种1m L含有3.51 05个细胞的L-1 5完全培养基。
在接种过程中,应注意保持细胞悬液的均匀性,避免细胞沉降铺板2 4h后,通过显微镜观察确认细胞在每个孔内形成融合的单层如果在孵育2 4h后尚未融合,可以在化学暴露前继续孵育2 4h4 8h8 试验程序8.1 试验条件试验条件如下:a)试验周期:2 4h;3G B/T4 6 1 4 42 0 2 5b)温度:1 91;c)光照:试验应在黑暗中进行8.2 试验浓度的选择试验的主要步骤流程见图1最高试验浓度的细胞活力与阴性对照或溶剂对照相比宜为0%最低试验浓度宜对细胞不产生影响,即与阴性对照或溶剂对照相比细胞活力为1 0 0%在正式试验之前进行预试验,从而选择适当的浓度范围预试验与正式试验相似,但设置浓度从受试物的水溶解度开始向下进行1 0倍稀释除了参考水溶解度之外,还可根据公式(1)的定量构效关系(Q S A R)来预测E C5 0(mm o l/L),以便在最低预期毒性浓度附近选择测试范围l o g E C5 0=-0.9 6(0.0 9)l o gKo w+1.5 7(0.2 8)(1)图1 试验的主要步骤流程图4G B/T4 6 1 4 42 0 2 58.3 细胞接种每测试一种受试物需要一块2 4孔板,同时为每批试验的阳性对照(3,4-D C A)额外准备一块单独的测试板。
从培养瓶中收集约11 07个R T g i l l-W 1细胞,2 4孔板除无细胞对照外(见图2),每孔接入1m L含有3.51 05个细胞的L-1 5完全培养基在接种过程中,应注意保持细胞悬液的均匀性,避免细胞沉降铺板2 4h后,通过显微镜进行观察,细胞应在每个孔内形成一个融合的单层(见图3)如果在孵育2 4h后尚未达到融合,可以继续孵育2 4h4 8h注:图中AD,16为2 4孔板上的序号图2 细胞接种到2 4孔板的移液方案示意图(每孔接种体积1m L)图3 R T g i l l-W 1细胞的融合单层图5G B/T4 6 1 4 42 0 2 58.4 试验溶液的制备8.4.1 阳性对照物和受试物贮备液的制备8.4.1.1 使用DM S O作为溶剂时,3,4-D C A贮备液的浓度应为最终暴露浓度的2 0 0倍,使试验溶液中有机溶剂的浓度不高于0.0 5m L/L制备2 0g/L的DM S O贮备液,并以此为起点用DM S O连续稀释获得各浓度的贮备液3,4-D C A的最高暴露浓度为1 0 0m g/L,以2倍间隔系数设置6个浓度,使孔中的暴露浓度为1 0 0m g/L、5 0m g/L、2 5m g/L、1 2.5m g/L、6.2 5m g/L和3.1 3m g/L。
应在试验当天制备3,4-D C A的系列稀释溶液8.4.1.2 按照与阳性对照相同的程序准备受试物的有机溶剂贮备液设置6个试验浓度,间隔系数不应超过2.5对于难测试物质,采用合适的方法配制贮备液,见参考文献1为了降低试验操作造成的化学损失和生物污染的风险(如长时间搅拌),可使用有机溶剂(如DM S O、甲醇或乙醇)配制贮备液若不使用有机溶剂,受试物应在无菌条件下直接溶解于L-1 5/e x培养基中,获得浓度合适的受试物贮备液8.4.2 阳性对照物和受试物试验溶液的制备在无菌条件下用L-1 5/e x培养基稀释贮备液制备试验溶液使用有机溶剂制备贮备液时,将已经梯度稀释的贮备液以12 0 0进行稀释如使用L-1 5/e x培养基制备贮备液,用L-1 5/e x培养基连续稀释贮备液至设置浓度试验溶液应在细胞暴露前新鲜制备8.5 细胞暴露铺板2 4h后,通过显微镜对细胞进行观察,细胞应在每个孔内形成融合的单层移除L-1 5完全培养基,用1m LL-1 5/e x培养基清洗所有孔,注意不要干扰细胞层移除L-1 5/e x培养基,然后分别加入2.5m L暴露介质:A 1孔加入浓度最高的试验溶液(C 1);A 2和A 3孔只加入L-1 5/e x培养基;A 4D 6孔在3个平行孔中加入各浓度试验溶液。
使用有机溶剂时的2 4孔板布局见图4 a),不使用有机溶剂时的2 4孔板布局见图4 b)加入暴露介质后,立即从对照组和各浓度组的3个平行孔中转移5 0 0L暴露介质到预先准备的取样瓶中用黏合箔或其他盖子覆盖多孔板,关闭盖子,于1 91的黑暗条件下孵育2 4h以上操作均在无菌条件下进行a)使用有机溶剂时的2 4孔板布局b)不使用有机溶剂时的2 4孔板布局注:图中AD,16为2 4孔板上的序号图4 细胞暴露时的2 4孔板布局图6G B/T4 6 1 4 42 0 2 58.6 细胞活力测定暴露结束后,从每孔中取5 0 0L暴露介质至各取样瓶中进行化学分析。