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1、 基于BiologECO技术的淮南采煤沉陷区水体微生物代谢多样性研究 柳炳俊摘 要：如何治理与利用高潜水位采煤沉陷区水资源，一直是困扰区域生态文明构建与经济协调发展的1个重要难题。该研究以我国东部典型采煤沉陷区淮南矿区为例，通过Biolog-ECO平板技术分析3个不同区域9个沉陷水体微生物的碳代谢多样性特征。结果表明，3个区域水体中异养菌数量、微生物代谢活性和香浓多样性指数均为潘集区八公山区凤台区。关键词：高潜水位；采煤沉陷区；Biolog-ECO平板；微生物代谢活性；多样性指数X52 A 1007-7731（2018）19-0101-04The Study on Metabolic Dive
2、rsity of Water Microbial Communities in Huainan Coal Mining Subsidence Area based on Biolog-ECO PlatesLiuBingjun（Anhui University，Hefei 23000，China；National Engineering Research Center for Coal Gas，Huainan 232001，China）Abstract：How to manage and utilize water resources in coal mining subsidence area
3、s with high phreatic level has always been an important problem that plagues the coordinated development of regional ecological and economic civilization. As Huainan mining area was the typical coal mining subsidence area in eastern China，carbon metabolism diversity of water microbes in nine subside
4、nce areas in three different regions was investigated by Biolog-ECO plate technique. The number of heterotrophic bacteria，microbial metabolic activity and Shannon diversity index of the three regions were showed Panji Bagongshan Fengtai. This study aims to provide theoretical support for the rationa
5、l planning and utilization of water resources in typical subsidence areas.Keywords：High phreatic level；Coal mining subsidence area；Biolog-ECO plates；Microbial metabolic activity；Shannon diversity index煤炭在我國的能源发展中一直占有极其重要的战略地位，在我国能源消费占比超过60%，其中2016年为62.3%。淮南矿区作为中国新型能源基地，是全国13个亿吨级煤炭基地之一，煤炭探明储量约为153亿t，
6、开采工艺采用多煤层综合机械化采煤。这种开采方式必然引发地表沉陷，研究表明淮南采煤沉陷系数约为0.71。淮南周边地表水系发达，有淮河干流与茨淮新河、颍河、西淝河、架河、泥河等众多支流。此外，淮南地区地下潜水位高，沉陷超过1m就常年积水，截至2016年底，淮南采煤沉陷区面积超过2.41万hm2，常年积水面积达0.90万hm2。如此连片的大面积水资源，如能将沉陷区环境治理与生态功能区建设结合起来，加以合理规划利用，势必对区域经济发展、生态环境治理，提供强大推助力。Biolog方法是由美国的BIOLOG公司于1989年研制成功，最初用于微生物菌种鉴定的一种便捷的方法。它是根据微生物对碳源的利用能力差异
7、，来描述群落中微生物的动态变化。其原理是发生在微生物利用碳源过程中产生的自由电子与四唑盐染料发生的还原显色反应，其颜色的深浅可以反映微生物对不同碳源的利用程度2。该方法借助于96孔微孔板，如革兰氏阳性板（GP）革兰氏阴性板（GN）和生态板（ECO）等来实现。Biolog-ECO微平板法通过采用底物诱导下的代谢响应模式来测算水体微生物群落代谢功能多样性，并用来描述不同区域微生物群落功能的差异3，吸光值平均变化率（AWCD）用于评价水体微生物群落对碳源利用的整体情况及代谢活性，Shannon多样指数用于评估微生物群落中物种的丰富度。因此Biolog-ECO平板技术可用于水体“原位”微生物群落代谢和
8、功能多样性的研究（Garland and Mills4，1991；郑华等5，2004；陈喜蓉等6，2017）。本研究首次采用Biolog-ECO平板技术对我国典型采煤沉陷区水体微生物群落代谢功能进行多样性调查分析，其研究成果将为沉陷区生态修复，水资源利用方向，打造淮南水域生态功能区提供科学数据。1 材料与方法1.1 采样布点 淮南采煤沉陷区根据沉陷类型主要划分为3大区域：凤台区（非稳沉区）、八公山区（稳沉区）和潘集区（半稳沉区）。每个区选择3个有代表的采煤沉陷水域采集水样，每个沉陷水域用采水器（1L）采集3个不同点位，混匀后置于1L无菌塑料瓶中，冰袋保存运回实验室，24h内检测结束，水质数据具
9、体详见表1。1.2 实验仪器 哈希溶解氧仪5500、哈希DR6000 紫外分光光度计、3洋MKR-352生化恒温培养箱、3洋MLS-375L-PC高压蒸汽灭菌器、Biolog Gen MicroStationTM 自动微生物鉴定系统。1.3 平板菌落计数 异养菌数量的测定采用MPN法，培养基为CM232水琼脂培养基（北京陆桥技术有限责任公司），将涂布好的平行平板在28下培养48h，对单克隆总数在30300的平板进行有效计数，并以计数平板上的单克隆总数作为0.1mL稀释样品中的异养菌总数。1.4 Biolog-ECO法 本实验采用31种碳源底物的Biolog-ECO板（Biolog Inc. H
10、ayward，CA，USA）分析水体微生物群落的碳代谢特征，即代谢功能多样性。根据底物的化学官能团及微生物代谢途径可将31种碳源划分为6大类7，其中聚合物4种、碳水化合物10种、羧酸类7种、氨基酸类6种、酚类2种、胺类2种。实验方法参照文献8的方法并略作修改，具体操作步骤如下：将样品混匀震荡静置10min，取5mL原水样置于95mL无菌生理盐水稀释至10-1梯度，将稀释后的水样置于无菌加样槽中，用8道移液器将水样加入平板的微孔中，每孔150L。每塊板设3个重复。微板加盖，28恒温培养7d，并于0、24、48、72、96、120、144、168h的时间点在590nm和750nm下测吸光度值，其中
11、数值小于0.06时按0处理。1.5 微生物代谢活性指标的计算 以颜色平均变化率（Average Well Color Development，AWCD）评判微生物群落对碳源的利用率，并以此指示群落的代谢活性。计算公式9如下：AWCD=（Ci-R）590-（Ci-R）750/n式中：Ci为所测定的第i个碳源孔的光密度值；R为对照孔的光密度值；n为培养基碳源种类数。参考闫法军等10的方法，采用Biolog-ECO微平板培养72h的数据进行分析，以Shannon指数计算群落代谢功能多样性，其算式为：H=-PilnPi。式中：Pi=ni/N；ni为第i种碳源孔的实际光密度值；N为样品中所有碳源孔实际光
12、密度值的总和。1.6 数据处理方法 采用SPSS17.0单因子方差分析（ one-way ANOVA）确定不同沉陷水体微生物群落碳代谢特征是否有显著差异（=0.05）。对不同微生物群落指标与水质的相关性分析采用Pearson分析法，通过其相关系数进行判定，数据的显著性水平设为p0.05和p0.01。2 结果与分析2.1 不同沉陷水体异养菌数量变化 图1反映出不同沉陷水体异养菌数量变化。凤台区水域异养菌数量显著低于其他2区（p0.05），细菌数量变化在（6.20.48）103（7.00.15）103cfu/mL。八公山区水域异养菌数量变化在（7.00.74）103（9.60.38）103cfu/
13、mL。潘集区异养菌数量显著高于上2个区域，且3个水域之间差异明显（p0.05）。2.2 不同沉陷水体微生物平均吸光值（AWCD）变化特征 水体微生物AWCD随时间的变化可以用来表示群落的代谢平均活性，能直观的体现微生物群落反应速度和最终达到的程度10。9个水体（潘集区、八公山区、凤台区）AWCD值随培养时间动态变化曲线见图1，从图1可以看出，所有水体微生物总体变化趋势为：12h内水体微生物碳代谢活性较低，24h以后随着培养时间延长微生物活性逐步增加，至144h后微生物活性达到最高后趋于平稳。水体微生物AWCD的动态变化范围为（0.29110.004）（1.15290.041），其中潘一矿沉陷区
14、AWCD最高为1.15290.041，张北矿最低为0.291100.004。对比不同水体微生物活性强弱可以明显看出潘一矿沉陷区AWCD明显高于其他区域（p0.05）；而张北矿沉陷区最低，顾桥矿，顾北矿显著高于张北矿沉陷区（p0.05）。2.3 不同沉陷水体微生物群落的代谢功能多样性变化根据Biolog-ECO板培养72h的AWCD值计算Shannon-Wiener指数，结果见图2。菌群多样性变化特征与碳代谢活性AWCD相似，水体微生物多样性最低的沉陷区依次是张北矿、顾桥矿、顾北矿沉陷区，分别为2.340.05、2.940.01、3.240.01，而潘一矿沉陷区群落多样性最高为3.640.003
15、，其他5个区域差异不显著（p0.05）。2.4 不同沉陷水体微生物群落代谢活性和多样性与水质的关系 如表2所示，异养菌数量与溶解氧（DO）成负相关关系（p0.01），与生物需氧量（BOD5）、化学需氧量（CODcr）、总磷（TP）成正相关关系。水体微生物群落代谢活性与水中溶解氧（DO）在p0.01水平上成负相关关系r=-0.880，与生物需氧量（BOD5）在p0.01水平成正相关关系，r=0.883，与化学需氧量（CODcr）在p0.05水平上成正相关关系，r=0.690，与水体PH、总氮（TN）、总磷（TP）相关关系不显著。水体微生物多样性与水中溶解氧（DO）成负相关关系（p0.05），r=
16、-0.744，与生物需氧量（BOD5）成正相关关系（p0.05），r=0.690，与CODcr、TP、TN显著关系较弱。3 讨论本研究结果显示，水体中微生物群落与水质具有密切关系。之前许多研究者从水中异养细菌数量、群落中优势菌组成情况进行分析11-12，本研究以微生物群落代谢活性、代谢功能多样性与不同种类的水质主要指标为切入点，通过系统的对比、分析，更全面地阐明了彼此的相关性。潘一矿沉陷区水体微生物碳代谢活性和群落多样性指数都高于其他沉陷水域，这一现象通过上述数据与水质关系分析得到了解释：潘一矿沉陷区受生活污水汇入和围网养殖等因素影响，水中有机物质较高，测得水域生物需氧量（BOD5）与化学需氧量（CODcr）均较其他沉陷区高，微生物代谢活性和多
