药典重组DNA技术产品的思考 《中国生物工程杂志杂志》2014年第七期 1制造 1．1总体要求 重组DNA技术产品安全有效的保障，不仅需要对目标产品的原液和成品进行质量控制，而且还需要对起始原材料和工艺过程进行充分控制即应对包括细胞株的来源、鉴别和检测、发酵或细胞培养、生产中使用的其它原材料、验证纯化工艺去除不需要物质的能力(特别是可能存在的病毒污染物、来自连续培养哺乳动物细胞的残余DNA、宿主细胞蛋白等)、生产工艺中的过程控制、因生产工艺的变化对产品质量安全和有效性的潜在影响，以及原液和成品全面的质量分析均给予必须和足够的重视 1．2起始原材料的控制 重组DNA技术产品须采用经过验证的细胞库系统进行生产，首先应将宿主与载体结合制备主细胞库，再由主细胞库制备工作细胞库并需建立相关文件，详细描述培养、提取、纯化的步骤以及对细胞库批次的定义如生产中使用人或动物来源的材料，则应符合病毒安全的有关要求 1．1．1表达载体和宿主细胞应提供宿主细胞和表达载体起源、来源、遗传背景和历史的描述，包括克隆基因的来源和特性、该基因的构建和鉴别情况，以及表达载体遗传特性和结构等详细信息。
同时应提供表达载体来源和各部分功能的说明，如:复制起始位点，启动子，抗性标记，限制性内切酶图谱等详细描述表达载体扩增、对宿主细胞的转化方法，以及生产用细胞克隆的筛选判定标准提供表达载体在宿主细胞中的位置和物理状态、如是否整合到染色体上，以及拷贝数和遗传稳定性资料明确插入克隆基因、表达载体控制区及其两侧的核苷酸序列，与表达有关或与产 品质量相关的核苷酸序列均应详细叙述同时也应详细描述在生产过程中控制、提高克隆基因在宿主细胞中表达水平的各种措施1．1．2细胞库系统重组DNA技术产品的生产中，其细胞库系统通常包括主细胞库和生产工作细胞库主细胞库(maincellbank，MCB)由含目的基因表达载体转化的原始细胞经传代扩增制成的均一悬液，并以等体积分装于单独容器中用于储存(如，在液氮中)在某些情况下，可能需要分别建立表达载体和宿主细胞的主细胞库工作细胞库(workingcellbank，WCB)是从主细胞库经有限传代而来的细胞材料的均一悬液，并以等体积分装于单独容器中用于储存(如，在液氮中)以上两种细胞库，所有的储藏容器应在相同条件下妥善保管，一旦取出使用，不得再返回库内储藏细胞库类型、容量、在预期使用频率下细胞库的寿命、保存使用的容器和封闭系统、包括冻存剂、培养基、冷冻保存步骤和存储条件等细胞库制备的方法均应详细记录在案，并提供在已优化储存条件下，库存细胞稳定性的证据。
1．1．3细胞库的控制应对主细胞库包括重组蛋白表达和/或表达载体在内的相应表型和基因型标记进行鉴定对特定主库细胞基质的检测，可根据细胞的生物学特性和培养的历史背景进行相应调整，并且该鉴定的范围和程度，可能会影响到后期生产阶段细胞基质所需常规检查的类型和级别应采用分子生物学或其他适合的技术对表达载体基因拷贝数、基因插入或缺失、整合位点数量等情况进行分析核酸酸序列应与表达载体一致，并与所预期表达的蛋白序列吻合由于支原体、病毒等外源因子污染动物来源的细胞基质后，可以进行扩增，同时逆转录病毒等内源因子也会引发安全问题，因此对细胞基质内、外源病毒因子的检测十分重要应制定和建立细胞库微生物有机体检测的策略和方法，并考虑采用适当的检测技术以确认某些特定病毒是否存在通常受到内、外源因子污染的细胞基质是不适合用于生产的但也存在例外，例如CHO和其他携带内源逆转录病毒的啮齿类细胞株，已广泛用于重组DNA技术产品的生产在这种情况下，应纳入风险降低与控制的策略，如在工艺中采用物理、化学或酶解等手段对其进行去除或灭活应提供建立工作细胞库的规程，每批WCB均应按规定进行一次全面的鉴别和纯度测定，并制定包括分析方法、判定标准的在内的WCB质量标准，新建WCB也应符合该质量标准的要求。
1．1．4细胞基质遗传稳定性应评估培养阶段细胞基质的稳定性，检测项目包括但不仅限于如:形态学特征，生长特征，生化标记，免疫标记，目的产物的表达量，或其他相关的基因型和核型标记插入的核苷酸序列应至少在每一个主细胞库培养期末进行一次确认长期发酵的多次收获物会导致一些质量属性的飘移，例如糖基化等出现的“新”的变体可能会影响产品的质量、安全和有效性这类飘移的管理应该在工艺验证研究中妥善地处理，明确宿主细胞在长时间培养后，表达产物分子的完整性，并且明确细胞基质的表型和基因型的特征，并综合上述特征提出生产用细胞最高限定代次 1．3生产过程控制 生物技术药物的生产工艺基础是采用活体表达系统进行目标产品的制备，主要包括细菌、酵母和哺乳动物细胞大规模培养技术等建议应采用适当的方式、检测频率，证实细胞培养过程中无细菌、酵母和霉菌污染由于某些生产细胞株可能或含有内源性逆转录病毒，因此应建立相应的工艺和可靠的分析技术，证明在培养过程中有效的将所有病毒清除或灭活对目标产品质量属性、生产工艺的深入理解和全面的设计，是建立可重复的、可控的工艺，保证稳定地生产出符合原液和成品质量标准的策略的一部分。
因此，生产工艺可接受标准的限度，应根据从研发早期到规模化生产的整个工艺生命周期范畴中所获得信息进行调整在原液和成品的生产中，需在关键决策步骤(criticaldecisionmakingsteps)实施工艺过程控制，其他工艺环节的支持数据可确保工艺的一致性对那些影响原液质量的工艺参数应制定可接受标准进行控制适当的工艺过程控制能够减少对原液和/或成品常规检测的需求 1．3．1细胞培养在生产过程中使用的每种材料(如:溶剂，试剂，酶)都应进行鉴定应提供对这些原材料来源、质量和控制的资料应适当提供证明这些原材料(包括生物来源的原料，如:培养基组成物，单克隆抗体，酶)符合既定用途质量标准(包括外来试剂的清除和控制)及物料供应商变更情况的资料1)有限传代水平的生产应限定生产过程中的传代或群体倍增的最高传代次数(将从细胞冻融到生产结束的最大允许天数定义为细胞寿命的限度是可接受的)应提供生产过程中培养、增殖和表达量一致性的数据确立终止培养、废弃培养物以及摒弃收获物的标准应提供经过长时间的培养后宿主细胞的表型、基因型特性以及所表达基因的分子完整性、一致性信息证明上述特征的试验所涉及的传代范围应超过规定的细胞最高限定代次。
还应建立生产末期宿主细胞/载体的一致性监测手段，如质粒拷贝数及其在宿主细胞内的状态等2)连续培养生产除上述要求外，细胞连续培养生产应根据系统稳定性和培养期间产品一致性的信息，明确连续培养的最长周期，并进行培养周期全过程的监测，监测类型及频率取决于产品和生产系统特点应提供生产中产品变异体或其它培养参数未超过标准限度的数据建立适合于收获阶段的微生物污染常规检测，明确收获物后续加工中对“批次”的定义根据宿主载体系统的稳定性和产品特性等确定对细胞、产品进行再评估的时间间隔常规生产过程中，无论采用上述哪种培养方法，还均应符合现行版《中华人民共和国药典》“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”的有关规定 1．3．2纯化(提取回收和纯化extraction，recovery＆purificaiton)从发酵液或细胞培养液中提取、纯化蛋白主要依赖于各种蛋白分离技术细胞培养或者酵母等真核发酵的优点是其蛋白产物大多都会分泌到培养液中，因此只要去除细胞或酵母就可以初步获得较高纯度的目的蛋白;而对于大肠杆菌等原核生产系统，常需要裂解细菌才能获得目的蛋白分离纯化中，来自宿主细胞破碎后的微量蛋白酶会破坏蛋白的稳定性，且很难被去除，因此快速纯化目的蛋白十分重要。
在采用各种分离纯化方法及任何新技术中，须保证分离纯化手段的稳定，如确保层析柱的柱效等性能一致并对纯化工艺中可能残存的有害物质进行严格检测，这些组分包括但不仅限于固定相或者流动相中的化学试剂、各类亲和层析柱的脱落抗体或配基、以及可能对目标产品关键质量属性造成影响的各种物质同时生物技术来源产品含有一些特定杂质，包括病毒、支原体等外源因子、核酸、宿主蛋白、内毒素以及源自培养液的各种其它残余物质，因此需特殊的工艺将其去除或降低至可接受的水平残留细胞DNA(rcDNA):生产工艺的优化应考虑到对残留宿主DNA片断的大小、残留量和生物活性的影响采用适宜的方式将rcDNA总量降至可接受的水平，并就降低rcDNA片段的大小、或者灭活其生物活性的方式进行说明通常产品中rcDNA水平应处于小于10ng/剂量至10pg/剂量的范畴病毒清除:对于人和动物源的细胞基质，病毒去除或灭活工艺均应充分显示能去除/灭活任何污染病毒、确保原液的安全性该工艺应在小规模研究中验证，并仔细选择所用指示病毒，以评估所选择生产工艺整体去除/灭活病毒的能力，并确定病毒载量下降程度明显达到安全性边界 1．4生产工艺变更 在重组DNA产品的生命周期中(lifecycle)，通常因工艺改进、规模扩大、场地变换、稳定性改进、或遵循法规要求的变化而进行相应的变更。
当生产工艺发生重大变更的时候，应对变更前后生产工艺对重组DNA产品质量、安全性和有效性的影响进行比较和评估这些可比性研究虽不意味着变更前后质量属性必须完全相同，但须证明它们的高度相似，并且现有知识能充分预测并确保任何质量属性方面的差异对安全性和有效性无负面影响并应解释重大变更的原因，评估变更对质量、安全和有效性的潜在影响 2质量控制 生物技术产品的质量控制与产品大小、结构特征、质量属性复杂程度和生产工艺相关其质量控制体系主要包括:原辅料检验和放行、生产和过程控制及文件、无菌工艺、常规放行检定等应通过终产品检测、过程控制和工艺验证结合的方法，确保各类杂质已去除或降低至可接受水平生物技术产品质量控制的基本原则同样包括使用参照物质、用经验证的方法来评估已知和/或潜在产品、工艺相关物质其和传统药物质控最主要差异是用于产品鉴别，一致性，纯度和杂质检测的分析方法不同 2．1表征分析在研发阶段以物理、化学和生物学方法对重组DNA产品的理化特性、生物学活性、免疫学特性、纯度和杂质等进行严格的表征分析鉴定是至关重要的，并有助于质量标准的确立对产品各种属性进行充分鉴定分析的初衷，是为了确保产品安全有效。
因此需采用广泛的分析技术来展示目标分子不同的理化性质(分子大小、电荷、等电点、氨基酸组成、疏水性等)对糖基化等各种翻译后修饰也应充分鉴定，并纳入适当的检测以确认产品具有预期的构象、聚集和/或降解状态及其高级结构并应在适合的时候或条件下，将各类新型分析技术应用于表征分析 2．1．1理化特性(1)一级结构一级结构，即包括二硫键连接方式的氨基酸序列应尽可能使用综合的方法测定目标产品的氨基酸序列，然后与其基因序列推断的理论氨基酸序列进行比较应注意可能存在的N末端甲硫氨酸(如:大肠杆菌来源的产品)，信号或者前导序列和另外可能的N、C末端修饰(如:乙酰化，酰胺化或者由于外肽酶导致的部分降解)，以及各种因N端和C端氨基酸序列变化导致的末端异质性(如:C端加工、N端焦谷氨酸、脱酰胺化，氧化，异构化，碎片化，二硫键错配，N-连接和O-连接的寡糖，糖基化，聚集)同时还应确定游离巯基和二硫键，并就二硫键的完整性和正确性进行分析2)糖基化修饰应对糖基化修饰进行全面的分析和确定，如糖基化修饰与清除和生物学活性相关，则应确定糖的含量(中性糖，氨基糖和唾液酸)另外，应尽可能对糖链的结构、糖型(触角、多糖本身的信息及特定位点的多糖分析)以及多肽链的糖基化位点进行深入分析。
应特别注意的是，糖型结构可能与不良反应相关(如非人类的糖型结构或其残基)，必要时应进一步就电荷异质性进行检测分析3)高级。