第10章 酶的作用机制和酶的调节 一 酶的活性中心（一）、活性中心(active site)的概念 活性中心：活性中心：酶分子中直接与底物结合并催 化底物发生化学反应的部位 活性中心分为结合部位和催化部位 结合部位：结合部位：负责与底物的结合，决定酶的专一性（与km有关） 催化部位：催化部位：负责催化底物键的断裂形成新键，决定酶的催化能力效率（kcat)和催化性质 结合部位和催化部位也可以合二为一，活性部位可以提供调节部位，也可以为活性部位提供物质基础 酶的活性中心 （二）、 活性中心的结构特点：1．活性部位在酶分子中只占一小部分（1％～2％）2．酶活性部位是一个三维的特定空间结构3．酶的活性部位和底物有时不互补-诱导契合4. 酶活性部位位于酶分子表面的一个裂缝内，裂缝 内往往是个疏水的微环境5．底物通过次级键结合到酶上，形成ES复合物6．酶活性部位是柔性或可运动性，即酶与底物结合 时构象发生一定的变化才互补 频率最高的活性中心的氨基酸残基： Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。
酶与底物结合成ES复合物主要靠次级键：氢键、盐键、范德华力和疏水相互作用底物可以稳定酶！！ 酶的活性中心 （三）、 研究活性中心的方法 化学修饰法通常是比较在底物或竞争性抑制试剂是否存在的情况下的化学修饰1、酶分子侧链集团的共价修饰（化学修饰）法 酶的化学修饰法分类（1）、非特异性共价修饰非特异性共价修饰 某些酶活性中心含有的活性基团在活性中心以外不存在或很少，这时可选择某些非特异性试剂进行修饰（2）、特异性共价修饰特异性共价修饰如DFP（二异丙基氟磷酸）可与活性中心中的丝氨酸反应如，DFP与胰凝乳蛋白酶作用（只和活性部位的丝氨酸残基的羟基结合） （3）. 亲和标记法 亲和标记亲和标记（Affinity labeling）：也属于共价修饰，主要是利用酶与底物特异性结合的原理而发展起来的一种特异性化学修饰法TPCK）修饰a－胰凝乳蛋白酶His57 何谓亲和层析何谓亲和层析 ？？ Ks型不可逆抑制剂又称( ? ) 研究活性中心的方法(续)2、动力学参数测定法 活性部位氨基酸残基(解离状态解离状态) )和(酶活性酶活性) )直接相关通过动力学方法求有关参数，对酶活性部位化学性质作出判断。
通过研究酶活性与pH关系，可以推测到与催化直接相关的某些基团的pK值，进而推测这些基团的作用 研究活性中心的方法(动力学分析法)核糖核酸酶最适 PH = 7.8 参照最适PH值：谷氨酸、组氨酸或赖氨酸哪一个可能在活性中心 ？？ 胃蛋白酶的最适PH值为2，哪一类氨基酸可能在活性中心？？ 研究活性中心的方法(动力学分析法) 酶 最适pH 活性中心的氨基酸胃蛋白酶 1.8 Asp215 和 Asp32胰蛋白酶 7.7 His57, Asp102, Ser195核糖核酸酶 7.8 His12, His119, 溶菌酶 5.2 Asp52, Glu35 研究活性中心的方法(续)4、定点诱变 通过改变基因来改变蛋白质的结构，制造新的蛋白质3、X－射线衍射分析法 通常是将酶与底物类似物或专一性抑制剂形成复合物，而后作X－射线衍射分析 例如：(溶菌酶活性中心） 定点诱变天冬酰胺天冬酰胺后Kcat小了5000倍结论：？结论：？苯丙氨酸后 Kcat不变 Km提高了6倍 结论：？结论：？胰蛋白酶突变突变突变突变羧肽酶A 为验证羧肽酶A Tyr 248 在催化中的作用，对其基因进行定点突变－Tyr 248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr 248 参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据： A. Kcat 突变后降低 B. Km 变大 C. Kcat/Km 升高 D. Kcat 不变 E. Kcat/Km 降低上海交通大学2007生物化学 定点诱变突变为苯丙氨酸后突变为苯丙氨酸后：Kcat不变， Km提高了6倍 （四）、酶的必需基团（自学） 必需基团：酶分子中与催化作用直接相关、不可缺少的化学基团。
（1）、活性中心内的必需基团： 结合基团：与底物结合，形成酶－底物复合物的部位； 催化基团：影响底物中化学键的稳定性，与底物发生 化学反应，将底物变成产物 （2）、活性中心外的必需基团（调控基团或维持酶活性） 构成酶活性中心的基团：His的咪唑基、 Ser的-OH、Cys的-SH、Glu的-羧基 1. 酶的必需基团是（ ） （1）必需基团构成具有一定空间结构的构象 （2）和底物结合幷将之转化成产物的部位 （3）抑制剂都作用于酶的活性中心 （4）所有酶的活性中心都有金属离子2. 酶的活性中心是（ ） （1）所有的酶都有活性中心 （2）所有活性中心都有辅基 （3）酶的必需基团都位于活性中心 （4）变构抑制剂直接结 合的部位 （5）重金属沉淀酶的结合区域3. 讨论酶活性中心的特点，指出两种常用于研究酶活性中讨论酶活性中心的特点，指出两种常用于研究酶活性中心心 的方法的方法( (8分分) )（大连理工大学、中国农业大学（大连理工大学、中国农业大学20112011生物化学）生物化学） 思考题 思考题5. 用定位点突变方法得到缺失某一个氨基酸残基突变体， 这个突变的酶蛋白不再具有催化活性，因此可以认为该缺失残基一定是酶结合底物的必需基团。
判断判断） 华南理工大学20096. 某同源蛋白中的某同源蛋白中的Ala残基被替换为残基被替换为Val，此类替换属，此类替换属 于于 保守性替换保守性替换 中山大学中山大学20097．．在酶的结构上十分重要，但在催化过程中极不可能和底物在酶的结构上十分重要，但在催化过程中极不可能和底物 相互作用，它是相互作用，它是( )( ) a. 谷氨酸谷氨酸 b. 胱氨酸胱氨酸 c. 组氨酸组氨酸 d. 酪氨酸酪氨酸 e. 丝氨酸丝氨酸江南大学江南大学2007 思考题8. 什么是酶活性中心？有一种酶，含一个半胱氨酸残基，设计一个技术线路，验证该Aa是否参与酶的催化作用或专一性 中国农业大学中国农业大学2010生物化学生物化学碘乙酸（碘乙酰胺）9 名词解释：酶的活性部位名词解释：酶的活性部位 20132013年山东大学年山东大学1010、判断：、判断：酶的活性中心由一级结构上相邻的氨基酸残基构成酶的活性中心由一级结构上相邻的氨基酸残基构成20132013年江南大学年江南大学华东师范大学华东师范大学20082008年年 酶高效性的机理1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物的形变与诱导契合3、酸碱催化4、共价催化5、活性中心金属离子6、活性部位微环境的影响二、影响酶催化效率的有关因素3版生物化学 酶促反应的机制（一）、（一）、 基元催化的分子机制：基元催化的分子机制： 基元催化：基元催化：由某些集团或小分子催化的反应，如 1、酸碱催化 2、共价催化 3、活性中心金属离子（二）、（二）、 酶具有高催化能力的原因酶具有高催化能力的原因 1、底物和酶的邻近效应与定向效应 2、底物的形变与诱导契合 3、多元催化与电荷极化 4、活性部位微环境的影响新版生物化学填空填空: : 一个是酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、 共价催化和( ) 中山大学中山大学20102010年年 （二）、 酶具有高催化能力的原因1. 邻近效应与定向效应Proximity/Orientation 底物与酶的邻近效应与定向效应邻近效应与定向效应变分子间反应为分子内反应。
邻近效应邻近效应：：酶与底物形成中间复合物中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度 定向效应定向效应：：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应 酶把底物分子从溶液中富集出来富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生 邻近与定向（轨道定向）效应A. 反应物的反应基团和催化基团既不靠近，也不彼此定向B. 两个基团靠近，但不定向，也不利于反应C. 两个基团既靠近，又定向，大大有利于底物形成过渡态，加速反应 酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能 ①、酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化 ②、底物形变，利于形成ES复合物 ③、底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能 （二）、底物形变和诱导契合的催化效应 溶菌酶 底物形变：酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象。
1、定义：酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用，降低了活化能加速了反应，这种机制称为... Specific acid-base catalysis （H+ 或OH-) General acid-base catalysis （H+ 或OH-) + 供体供体2、分类（三）、酸碱催化酶酶酶酶 Many protein enzymes use general acid-base catalysis as a way to increase reaction rates（（催化有机反应的最普催化有机反应的最普遍有效的催化剂遍有效的催化剂）） Acid-Base CatalysisSpecific acid–base catalysisGeneral acid-base catalysis The active site of some enzymes contain amino acid functional group, such as those shown here, can participate in acid-base catalysispKa value*Asp 3.9; Glu 4.1 Lys 10.5; Arg 12.58.36.013.010.5Side chains used in general acid-base catalysis The active site of some enzymes contain amino acid functional group, such as those shown here, can participate in acid-base catalysis pKa value* PH = 7 -COOH Asp 3.9; Glu 4.1 COO- -NH3+ Lys 10.5; Arg 12.5 NH3+ 组氨酸组氨酸-6.0Side chains used in general acid-base catalysis 思考题 例如：某酶的化学修饰实验表明，Glu和Lys残基是这个酶活性所必需的两个残基。
根据pH对酶活性影响研究揭示，该酶的最大催化活性的pH近中性请你说明这个酶的活性部位的Glu和Lys残基在酶促反应中的作用，并予以解释 [答] 谷氨酸的ā-羧基的pKa值约为4.0，在近中性条件下，该基团去质子化，在酶促反应中起着碱催化剂的作用赖氨酸的?-氨基的pKa值约为10.0，在近中性条件下，它被质子化，在酶促反应中起着酸催化剂的作用 3、影响酸碱催化反应速度的两个因素 ⑴⑴ 酸碱强度酸碱强度(pK值）组氨酸咪唑基的解离常数为6， 在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼 的催化基团 ⑵ ⑵ 给出质子或结合质子的速度给出质子或结合质子的速度咪唑基最快，半寿期 小于10-10 秒 酸碱催化所以，所以，His是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团是酶中最有效最活泼的一个催化功能基团 思考题 1. 在酶的广义酸碱催化机制中，特别重要的一个氨基酸残基是 ____，其侧链pK 值接近生物体的pH 值 中山大学中山大学2007年年2. 蛋白酶的酸碱催化作用加强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。
是非题） 中山大学中山大学2009年年3. 名词解释：酸碱催化 华东师范大学华东师范大学2003年年 思考题 4. 在生理条件下，下列哪种既可以作为H+的受体，也可以作为H+的供体? （A）His的咪唑基（B）Lys的ε氨基（C）Arg的胍基 （D）Cys的巯基 （E）Trp的吲哚基 华东师范大学华东师范大学 2007年年 Nucleotides H2O2`或或3`-核苷酸核苷酸核苷核苷2`,3`环磷酸酯环磷酸酯 Basic hydrolysis of RNA Due to the 2’-hydroxyl (1). 共价催化：酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度。
四） 共价催化Covalent catalysis酶酶底物底物共价键共价键 （2）.共价催化分类① ① （酶中）（酶中） 亲核基团：（亲核催化）亲核基团：（亲核催化） Ser 的羟基、的羟基、Cys 的硫基，的硫基， His 的咪唑基、的咪唑基、Asp 的羧基，的羧基，等；这些富含电子的基团等；这些富含电子的基团( (有孤对电子有孤对电子) )，攻击底物分子中电，攻击底物分子中电子云密度较小的亲电子基团（子云密度较小的亲电子基团（底物中常见的亲电集团：底物中常见的亲电集团：如磷如磷酰基、酰基和糖基），并供出电子，二者形成共价键，酶和酰基、酰基和糖基），并供出电子，二者形成共价键，酶和底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物底物形成一个不稳定的中间物，进而转变为产物② ② （酶中）亲电子基团：（亲电催化）（酶中）亲电子基团：（亲电催化） H+ 、、Mg2+、、 Mn2+ 、、Fe3+ 某些辅酶，如焦磷酸硫胺某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用 共价催化集团 共价催化举例-胰凝乳蛋白酶1. 亲核催化中酶蛋白上最常见的提供亲核基团亲核基团的残基是（ ） A，His，Ser，Cys； B，His，Lys，Arg； C，Asp，Glu，Phe D，Asn，Gln，Trp 中国科学院中国科学院20052005年年 共价催化举例-胰凝乳蛋白酶2. 酶蛋白氨基酸侧链提供各种亲核中心，可以对底物进行共价催化，酶蛋白上最常见的 3 种亲核基团为：( ),( )， ( )。
底物的亲电中心主要有： （至少写出2 种） 中国科学技术大学中国科学技术大学2007-20082007-2008学年第学年第I I学期生物化学学期生物化学 （区分）可逆的共价修饰的调控 （1）共价修饰调节：酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生可逆的共价修饰,从而导致酶活性的改变,称为共价修饰. （2）共价调节酶（covalent regulatory enzyme） 是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性共价调节酶） （五）、活性中心金属离子的催化作用金属酶 和金属-激活酶（1）通过结合底物位反应定向；（2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷 金属离子的催化往往和酸的催化相似，作用比质子强，不少金属离子有络合作用，并且在中性 pH 溶液中，H+ 浓度很低，但金属离子却容易维持一定浓度 金属离子通过电荷的屏蔽促进反应金属离子通过水的离子化促进亲核催化 Hexokinase激酶真正的底物是 Mg2+-ATP Carbonic Anhydrase: Zinc Activation of Water, The activated water (hydroxide ion) acts as a nucleophile亲和基团 , attacking the carbon dioxide, forming bicarbonateCarbonic Anhydrase The bound zinc activates its water ligand - makes it more reactive 基元催化基元催化：：由某些集团或小分子催化的反应，如 1、酸碱催化 2、共价催化； 3、活性中心金属离子 基元催化的分子机制基元催化的分子机制 思考题：思考题： 1. 酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和（ ）中山大学中山大学20102010年年2. 下列哪一项不是酶具有高催化效率的因素？ （ ） A、加热 B、酸碱催化 C、“张力”和“形变” D、共价催化 E、邻近定位效应南京林业大学南京林业大学20032003年年 多元催化和协同催化：多元催化多元催化和协同催化：多元催化常常是几个功能团适当排列共同作用。
如胰凝乳蛋白酶活性中心处三个氨基酸残基组成“电荷中继网电荷中继网”，催化肽键水解电荷极化电荷极化为基元催化提供了催化基团，如广义的酸碱、亲核基团和亲电基团及金属离子六）、多元催化与协同效应电荷极化和多元催化(新版生化）Ser195、His57、Asp102 Example: RNase AA AGeneral BaseGeneral Acid牛胰核糖核酸酶A酶的活性中心：His12 His119 Lys41 49Example: RNase A （七）活性中心的微环境 （1）疏水环境：酶的活性中心周围的环境是一个非极性环境，即低介电环境，在低的介电环境中排斥水分子，酶的催化基团和底物分子的敏感键之间有很大的反应力，有助于加速酶促反应如果酶的活性中心周围是一个高介电环境中，活性中心就会有水分子存在，水分子对带电离子有屏蔽作用，削弱带电离子之间的静电作用，不利于酶促反应的进行 （ 2）电荷环境 在酶活性中心附近,往往有一电荷离子,可稳定过渡态的离子,增加酶促反应速度 活性中心的微环境 酶活性中心的羧基与水形成氢键，导致酶活性中心羧基表面有一层水化层，水分子的屏蔽作用，大大削弱了酶分子与底物离子间的静电相互引力，不利于酶促反应。
思考题1. 酶的特殊基团的催化作用是指酸碱催化、共价催化和（ ） 中山大学2010年生物化学2．．哪一种酶属于共价催化（哪一种酶属于共价催化（ ）？）？ a. 解链酶解链酶 b. DNA聚合酶聚合酶 c. RNA聚合酶聚合酶 d. 拓扑异构酶拓扑异构酶 e. 蛋白激酶蛋白激酶A 江南大学2007年生物化学 Type I topoisomerases共价催化 三、 酶催化作用的实例（一）、溶菌酶（一）、溶菌酶（lysozyme) 溶菌酶存在于鸡蛋清鸡蛋清和动物的眼泪动物的眼泪中，其生物学功能是催化某些细菌细胞壁的多糖水解，从而溶解细菌的细胞壁溶菌酶是第一个用X-射线法阐明其全部结构和功能的酶是1922年伦敦细菌学家弗莱明(Fleming)首次发现的1. 底物：底物：细菌细胞壁的肽聚糖， NAG和NAM交替排列形成多聚物，它们之间通过β-1,4糖苷键相连。
为什么眼睛和口腔不易被细菌感染？2011年四川大学生物化学年四川大学生物化学 肽聚糖（peptideglycan)LysozymePenicillin 注意：含有D-氨基酸 溶菌酶的最适小分子底物 溶菌酶的最适小分子底物为NAG-NAM交替形成的六糖6个糖环分别用A 、B、C、D、E、F表示溶菌酶水解D糖环和E糖环之间的糖苷键 溶菌酶的最适小分子底物 O18水证明溶菌酶催化底物C1-O键裂解 2、溶菌酶结构： 溶菌酶由129个氨基酸残基构成，是一个单链蛋白，分子内含有四对二硫键活性中心的氨基酸残基是Glu35和Asp52 从表面构象看，酶的结构不很紧密，大多数极性氨基酸残基分布在分子的表面，非极性氨基酸残基分布在分子的内部整个酶分子中有一狭长的裂缝一狭长的裂缝最适底物正好与酶分子的凹穴相结合. 3. 溶菌酶催化特点小结§（1）靠近与定向§（2）底物形变：酶与底物结合后，D 糖环构象发生变形，从正常的能量较低的椅式构象变为能量较高的半椅式构象§（3）广义的酸碱催化§（4）共价催化 ? 溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它们的侧链羧基COOH的pK a 值分别为5.9和4.5。
该酶最适pH（pH5.2），1. 这两个残基分别呈现什么样的解离状态（质子化或否）？2. 这样的解离状态将使它们分别发挥什么样的作用？（谁起酸催化作用？谁起稳定正电荷作用？），3. 根据该酶的pH-活性峰，请对这两个残基的解离与该酶的活性之间的关系给出恰当的解释 武汉大学生命科学学院2007-2008年度第1学期期末考试 武汉大学生命科学学院2007-2008年度第一学期期末考试 1.Optimum pH for the enzyme is ~5. The reason for this lies in the ionization state of both Glu-35 and Asp-52:1.At pH>5: Glu-35 ionizes and can not supply the hydrogen ion required.2.At pH<5: Asp-52 is protonated and can not stabilize the carbocation 3. intermediate. 溶菌酶活性部位含有Glu35和Asp52，它们的侧链羧基COOH的pK a 值分别为5.9和4.5。
该酶最适pH（pH5.2）， 溶菌酶两种催化机理假说广广义义的的酸酸碱碱催催化化广广义义的的酸酸碱碱催催化化正正碳碳离离子子共共价价催催化化?D糖 溶菌酶两种催化机理假说(续)广义的酸碱催化广广义义的的酸酸碱碱催催化化 溶菌酶催化机理假说(旧) 溶菌酶主要活性基团是Clu35的γ－COOH和Asp62的b－COOH，在游离状态下，Glu和Asp这两个羧基的解离常数差异不显著，但在酶分子内， Clu35残基处在非极性环境中，因此其羧基不解离(起广义酸碱催化)，而Asp52残基则处于极性微环境中，其b－COOH可解离(协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用)由于微环境差异导致羧基解离状态不同，从而使此酸可以利用相应基团进行酸碱催化反应 Glu35的羧基起广义酸碱催化，向底物D糖环和E糖环之间的糖苷键上的氧原子提供一个质子，氧原子与D糖环C1的糖苷键断开，D糖环的C1 带上正电荷成为正碳离子Asp52上的-COO-起协调糖苷键断裂和稳定正碳离子的作用 思考题1、 判断判断：溶菌酶的最适pH为5.2，在此pH二侧活性下降的主要原因是活性中心Asp和Glu的不恰当解离 南开大学南开大学20012001年年 2. 判断判断：溶菌酶水解的底物是N-乙酰氨基葡萄糖的聚合物（） 中国科学院中国科学院20032003年年 思考题北京科技大学北京科技大学20112011年年3、、 （二）、核糖核酸酶（二）、核糖核酸酶A（RNase A）RNA 的碱水解机制的碱水解机制 牛胰核糖核酸酶A酶的活性中心：His12 His119 Lys41 General AcidGeneral Base核糖核酸酶A水解机制 牛胰核糖核酸酶A催化机理General AcidGeneral Base 羧肽酶A（carboxypeptidase A）是一个具有307氨基酸的单链蛋白质，其中紧密地结合着一个锌离子锌离子，它对酶活性很重要。
羧肽酶A：Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基羧肽酶B：仅Arg、Lys，如果C-末端第二个残基是Pro,则酶A和酶B都不起作用.羧肽酶C能水解C-末端的Pro.）锌离子在羧肽酶A的活性部位上与两个组氨酸侧链和一个谷氨酸侧链和一个水分子相配位（三）、羧肽酶A（carboxypeptidase A）催化中心催化中心结合中心结合中心 1、为验证羧肽酶A Tyr 248 在催化中的作用，对其基因进行定点突变－Tyr 248（TAT）定点突变为Phe（TTT）；实验结论是，Tyr 248 参与了与底物的结合，但不是催化所必须的，此结论必定来自如下数据： A. Kcat 突变后降低 B. Km 变大 C. Kcat/Km 升高 D. Kcat 不变 E. Kcat/Km 降低上海交通大学2007生物化学 定点诱变2、 判断：用羧肽酶A 水解一个肽，发现从量上看释放最快的是 Leu，其次是Gly，据此可断定，此肽的C 端序列是：Gly-Leu. （ ） 华南理工大学2007年 (四）、丝氨酸蛋白酶 一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理相似，一些酶的活性中心一级结构结构与催化机理相似，可把它们归为一族。
可把它们归为一族蛋白水解酶：蛋白水解酶： （1）丝氨酸蛋白酶家族（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等） （2）锌蛋白酶家族（羧肽酶等） （3）巯基蛋白酶家族（木瓜蛋白酶等） （4）羧基蛋白酶家族（胃蛋白酶等）1、名词解释: 丝氨酸蛋白酶 山东大学山东大学 2011 2011 生物化学生物化学 2、胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶典型的催化机制：广义酸碱催化共价催化活性中心由Ser195、His57、Asp102 组成； Ser195的活性中心确定：用DIFP（二异丙基氟磷酸）进行化学修饰有机磷杀虫剂）က His57的催化活性确定：用不可逆抑制剂TPCK（N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮）က水解过程分酰化和脱酰两个阶段 没有底物时没有底物时结合底物时结合底物时电荷中继网3、胰凝乳蛋白酶的催化三联体 丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser -His-Asp催化三联体 电荷中继网： 通过电荷中继网进行 没有底物时： Ser195—His57—Asp102形成一个氢键体系， His57是去质子化状态， Asp102的COO-通过氢键定位并固定His57。
结合底物时： His57从Ser195接受一个质子，增加了Ser195羟基氧原子对底物的亲核攻击性， Asp102的COO-稳定过度态中His57的正电荷形式 胰凝乳蛋白酶的催化三联体 胰凝乳蛋白酶的活性中心结合部位：决定专一性催化部位 丝氨酸蛋白酶的专一性 丝氨酸蛋白酶的活性中心位于酶分子表面凹陷的小口袋中，口袋的大小以及口袋内的微环境（疏水性、电荷性质）决定了丝氨酸蛋白酶的底物专一性趋异进化 丝氨酸蛋白酶的趋异进化P409P408 丝氨酸蛋白酶的专一性 胰凝乳蛋白酶 ：口袋较大，主要由疏水氨基酸残基围成，开口较大（由两个Gly组成），因此需要底物有一个疏水基团（芳香环Phe、Tyr、Trp及大的非极性侧链）定位裂解芳香族氨基酸羧基侧的肽键 胰蛋白酶：口袋较大，底部有Asp，利于 Lys.、Arg结合，裂解碱性氨基酸残基羧基侧的肽键 弹性蛋白酶：口袋较浅，开口较小（由Val，Thr组成）只能让Ala等小分进入，裂解小的中性氨基酸残基羧基侧的肽键 结合结合中心中心 4. 胰凝乳蛋白酶的催化机制P409 胰凝乳蛋白酶的催化机制P4092. 蛋白酶的酸碱催化作用加强了共价键化基团对肽键碳原子的亲核进攻能力。
是非题） 中山大学中山大学20092009年年 胰凝乳蛋白酶的催化机制Activation Of Ser residuecovalent linkage with carbonyl group of polypeptide chain andFormation of tetrahedral inter-mediate transition state• Cleavage of peptide bond,释放C端肽链第第1次四面体过渡态中间物次四面体过渡态中间物第第1阶段：阶段： 酰化酰化NC 胰凝乳蛋白酶的催化机制•Activation of water molecule by pairing with its hydrogen atom (through a basic residue)Formation of second tetrahedral intermediate transition stateRegeneration of Ser residue by a protonated basic residue第2次四面体过渡态中间物第第2 阶段：脱酰阶段：脱酰 Enzyme Mechanisms – ChymotrypsinBiochemistry 3070 – Enzyme Mechanisms 胰凝乳蛋白酶反应的详细机制 第一阶段： 酰化 Ser195--OH 中的氧攻击肽键的羰基碳（共价催化），酶的His57咪唑H+与底物中的-NH形成氢键（酸碱催化），形成四联体过渡态（Ser195—O-、底物的羰基C、底物的-NH、His的咪唑H+ ），肽键断裂氨基产物释放，底物的羧基部分共价酯化到Ser195的羟基上。
第二阶段： 脱酰 电荷中继网从水中吸收一个质子，结果产生的OH-攻击连在Ser195上底物的羰基C原子，形成四联体过渡态，然后His57供出一个质子给Ser195上的氧原子，底物中的酸成分从Ser195上释放 The Structure Folds of Chymotrypsin vs Substilisin枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 趋同进化趋同进化•The overall folds of two members of different superfamilies of serine protease. The enzymes are chymotrypsin (top) and subtilisin (bottom). The residues in the catalytic triad are indicated for each)来源不同，功能特征相同，称异源的趋同进化 胰凝乳蛋白酶中是：胰凝乳蛋白酶中是： Asp102-His57-Ser195 枯草杆菌蛋白酶是：枯草杆菌蛋白酶是： Asp32-His64-Ser221Chymotrypsin 酸碱度影响胰凝乳蛋白酶 In summary of Serine Proteases胰凝乳蛋白酶典型的催化机制： 广义酸碱催化 共价催化。
活性中心由Ser195-His57-Asp102 组成；1. Asp102的确定:identified by X-ray crystallography2. Ser195的确定:用DIFP（二异丙基氟磷酸）-化学修饰3. His57的催化活性确定：用不可逆抑制剂TPCK-亲核标记水解过程分酰化（Acylation）和脱酰（Deacylation）两个阶段 课后题课后题 9.胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因素引起这些差异？因素引起这些差异？ 答：相似之处：相似之处：①执行相同的反应——裂解肽键；②其结构和作用机制很相似；③相对分子质量范围在 2.5×103 ， 并且具有相似的顺序和三级结构；④ 3 个极性残基—— His57、Asp102 和 Ser195 在活性部位形成催化三联体 不同之处不同之处：①专一性不同 它们的活性中心是由两个天冬氨酸残基所组成，如由胃膜分泌的胃蛋白酶、肾脏中的血管紧张素释放酶及细胞溶酶体中的某些组织蛋白酶等。
胃蛋白酶是典型的天门冬氨酰蛋白酶一条肽链，相对分子质量为35×103；胃蛋白酶的活性中心含有一水分子，水分子的两翼是Asp 215和Asp32（当一个天冬氨酸为离子化形式，另一个为非离子化形式时酶才表 现其活性；天冬氨酸在酶的催化过程中起两个作用：激活它们之间的水分子，充当质子 的受体和质子的供体，形成催化二联体，进行广义的酸碱催化） （五）、天冬氨酸蛋白酶 天冬氨酸蛋白酶天冬氨酸天冬氨酸-活化水活化水 思考题1. 胃蛋白酶偏酸性，这说明其有哪些官能团？有哪些氨基胃蛋白酶偏酸性，这说明其有哪些官能团？有哪些氨基酸提供这些官能团？酸提供这些官能团？ 大连理工大学大连理工大学2012年生物化工专业生物化学年生物化工专业生物化学 2. 苏州大学2004 年生物化学考研试题 1) 举例说明竞争性抑制原理及应用 2) 以溶菌酶或糜蛋白酶为例说明酶作用机理 思考题3. 胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的三维结构相似，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶的三维结构相似，活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列也完全相同，活性中心的丝氨酸附近的氨基酸序列也完全相同， 但作用的但作用的底物各不相同。
底物各不相同 试根据底物的结构特点推测三种酶作用部位试根据底物的结构特点推测三种酶作用部位的结构特点的结构特点 厦门大学2004年4. 胰凝乳蛋白酶的活性中心中构成一个电荷中继网的三个氨基酸残基是: ( ) A, HIS,Arg,Glu B ,Ser,Lys,Asp C, Ser,His,Asp D, Ser,Arg,Glu江苏大学2005年 思考题5. 利用利用DIFP对胰凝乳蛋白酶进行化学修饰对胰凝乳蛋白酶进行化学修饰,DIFP在温和条件下在温和条件下只与酶上的一个只与酶上的一个Serl95结合结合, ,化学修饰后化学修饰后, ,酶失去活性酶失去活性, ,且此酶也且此酶也不能再与最适底物类似物不能再与最适底物类似物TPCK结合结合, ,说明说明Serl95是（是（ ））: : A. 别构部位别构部位 B. 催化部位催化部位 C. 底物结合部位底物结合部位 D. 与酶的催化活性无关与酶的催化活性无关。
天津工业大学2007年6、、酶催化反应的本质是降低达到反应平衡的活化能，请用酶催化反应的本质是降低达到反应平衡的活化能，请用实例说明共价催化、酸碱催化降低活化能的机理实例说明共价催化、酸碱催化降低活化能的机理 2008 2008 年中国农业大学年中国农业大学 思考题8、判断：丝氨酸蛋白酶反应的动力学属于乒乓机制 中国海洋大学研究生考试真题中国海洋大学研究生考试真题2011生化生化 9．欲较彻底的水解丝心蛋白，选用（ ）为宜A.弹性蛋白酶 B.胰蛋白酶 C.胰凝乳蛋白酶 D.嗜热菌蛋白酶南开大学南开大学 2002 2002 年年10．判断：二异丙基磷酰氟是胰蛋白酶的亲和标记 南开大学南开大学 2001 2001 年年 四 、 酶活性的调节控制调节酶：活性可被调节的酶，主要是2. 酶在生物体内的调节主要有别构调节和（ ）? 中山大学2009生物化学别构酶别构酶共价修饰酶共价修饰酶 （1）别构效应别构效应（又称为变构效应）：别构中心结合了效应物后，导致酶的构象发生改变，影响了活性中心对底物的催化作用。
某些物质能以非共价键形式与酶活性中心以外特定部位结合,使酶蛋白分子构象发生改变,从而改变酶的活性.）（（2））别构酶别构酶：：各种配体与酶的结合后，酶发生的构象变化，导致后继配体的亲和力改变的酶， 别构调节不引起酶的构型变化，不涉及共价键变化P413 （一）别构调节 （3）. Allosteric effectors别构调节物（别构效应物：Allosteric effectors）：与别构酶分子中的别构中心（调节中心）非共价结合后，诱导生或稳定了酶分子的某种构象，从而调节酶活性中心对底物的结合 A positive effector activates the enzyme (an activator). A negative effector inhibits the enzyme (an inhibitor). activatorinhibitor (1) 根据配体性质分： 同促效应同促效应：当一个效应物与酶结合后，影响另一相同的效应物与酶的结合 异促效应异促效应：当一个效应物与酶结合后，影响另一不同效应物与酶另一部分结合2) 协同效应：一个效应物分子与变构酶的结合，对第二个效应物分子的结合产生影响，为协同效应 正协同效应正协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，有利于后续底物分子或调节物分子的结合 负协同效应协同效应：指效应物分子与变构酶的结合后，本身构象发生变化，不利于后续底物分子或调节物分子的结合2、别构效应的种类：P248 别构效应的种类别构效应的种类 3. 别构酶的结构特点(1) 已知的别构酶一般都是寡聚酶，通过次级键结合。
2) 具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心和别 构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上3) 多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同位效应， 底物就是调节物：有的别构酶 不止一个别构中心，可以接受不 同的代谢物（非底物）的调节P418 不遵循米式方程，动力学曲线是S型（正协同效应）或表观双曲线（负协同效应）V—[S]的动力学曲线米氏酶：rectangular hyperbolic curve(直角的双曲线直角的双曲线) 别构酶： 同促同促正正协同效应协同效应: sigmoidal curve("S-shaped")（S-形曲线） 同促同促负负协同效应协同效应：：（表观双曲线） 不加激活剂或抑制剂不加激活剂或抑制剂P418 4. 别构酶的V—[S]的动力学曲线 米氏酶： 直角的双曲线 别构酶的动力学特点 别构酶的动力学特点 试用动力学曲线图区分非调节酶,正协同效应别构酶和负协同效应别构酶并加以解释(15分).S-形曲线直角的双曲线表观双曲线杭州师范大学2008 年 ① 同促正协同效应的别构酶是S型曲线 当底物浓度发生较小变化时，别构酶可以极大程度地控制反应速度。
米氏酶： [S]0.9/[S]0.1=81 别构酶（n=4）：[S]0.9/[S]0.1=3 表明表明反应速度对底物浓度的变化敏感，当底物浓度发生较小变化时，如上升3倍，别构酶的酶促反应速度可以从0.1Vmax升至0.9Vmax ② 同促负协同效应的别构酶是表观双曲线 表明反应速度对底物浓度的变化不敏感Allosteric Enzymes - Kinetics curve不加激活剂或抑制剂 加激活剂或抑制剂③ 调节物的别构效应(异位效应）က 当增加正调节物浓度时，Km减小，亲和力增大，协同性减小（对底物浓度的反应灵敏度降低） က 当增加负调节物的浓度时，Km增加，亲和力减小，协同性增大（对底物浓度的反应灵敏度增加 正协同-别构酶的动力学曲线（自学） 别别 构构 酶酶 in summary The kinetic properties of allosteric enzymes diverge from Michaelis-Menten behavior 米氏酶：直角的双曲线 别构酶： 同促正协同:S-形曲线 同促负协同:表观双曲线 ① Hill系数法 米氏酶：n=1 别构酶-正协同： n＞1 ，越大，正协同性越大 别构酶-负协同： n＜1 ，越小，负协同性越大别构酶的鉴定② 饱和比值（saturation ratio, Rs)③ 双倒数作图不是直线④ 脱敏作用（P183)： 理化处理后，仍保持活性，但失去调节性质。
脱敏后的别构酶表现为米式酶的动力学曲线P4195、别构酶的鉴定 Rs = 酶与底物结合达到90%饱和度时的底物浓度 酶与底物结合达到10%饱和度时的底物浓度 米氏酶：当反应速率为0.9Vmax时，[S]=9Km 当反应速率为0.1Vmax时，[S]=1/9Km Rs=81正协同：Rs＜81，越小，正协同性越大负协同：Rs＞81 ，越大，负协同性越大 饱和比值（saturation ratio, Rs) 米氏酶： Rs=81正协同： Rs＜81负协同： Rs＞81 Hill系数法 米氏酶：n=1 正协同： n＞1 ，越大，正协同性越大 负协同： n＜1 ，越小，负协同性越大Hill系数法 6、别构酶调节活性的机理(1)、、齐变模型齐变模型 （（WMC模型）模型） (2)、、序变模型序变模型（（KNF模型模型））不能解释负协同 别构酶调节活性的机理齐变模型（WMC模型）①亚基以对称方式排列，整个酶分子以两种构象存在，松弛型（R）和紧张型（T）R型有利于与底物结合，T型不利于与底物结合②同一酶分子中不存在构象杂合体（RT态），它的亚基要么是R型，要么是T型。
③两种构象状态间的转变，对每个亚基来说都是同时的，齐步发生的①④ 当底物不存在时，绝大多数酶分子均为T型，加入底物后，T型各亚基齐步向R型转变不能解释负协同 变构调节的特点和生理意义7．变构调节的特点：⑴ 酶活性的改变通过酶分子构象的改变而实现；⑵ 酶的变构仅涉及非共价键的变化；⑶ 调节酶活性的因素为代谢物；⑷ 为一非耗能过程；⑸ 无放大效应8、变构调节的生理意义： ⑴ 调节代谢的速度和强度 ⑵ 调节代谢的方向，由分解改为合成，防止产物 过剩，使多余能源合成储存 ⑶ 调节能量代谢的平衡 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）：是了解最清楚的一个别构酶它催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个中间物N –氨甲酰天冬氨酸的合成，ATCase受其代谢途径的终产物CTP 的别构抑制 9、别构酶举例P413 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）（1）、结构： ATCase 由两个三聚体构成的催化亚基（C3）和三个二聚体构成的调节亚基（r2）组成当催化亚基和调节亚基混合时能迅速结合 （2）、特点：同促效应：异促效应正协同：天冬氨酸抑制剂 CTP激活剂 ATP表现出齐变模型特征 ATCase reaction and its kineticsAllosteric effects in ATCase CTP is an inhibitor ATP is an activator Sigmoidal kinetics 天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase） 天冬氨酸的结合具有正协同的效应（所以反应速度对天冬氨酸浓度作图得到的是S形曲线） CTP终产物反馈抑制：降低酶与底物的亲和力，不改变Vmax CTP使得原来的S曲线更为明显，表明天冬氨酸结合ATCase的过程中具有更大的协同性。
ATP激活：增加酶与底物的亲和力，不改变Vmax，别构激活剂ATP的存在使得S型曲线向双曲线漂移，降低了底物对酶结合的协同性 课后题课后题-11 11. 对于 ATCase 来说，琥珀酸起着 Asp（两个底物中的一个）的竞争抑制作用υ 对[Asp]的依赖关系见图 1071A（假设这些实验中第二种底物是过量的并可忽略）在图 1071B种[Asp]维持在低水平（图1071A种箭头所指处）不变，并加入一系列含量递增的琥珀酸琥珀酸不能作为底物参与反应请解释这些结果 天冬氨酸转氨甲酰酶（天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase））（4）、N一磷乙酰基L一天门冬氨酸（PALA）是研究天门冬氨酸转氨甲酸酶（ATCase）性质的特异性试剂？（为ATCase强的抑制剂），PALA的结构与ATCase两个底物复合物的结构类似，即与氨甲酸一天门冬氨酸复合物的结构类似PALA是结合在ATCase的活性部位比较ATCase和ATCase－PALA复合物的X一射线衍射分析结果发现，随着PALA的结合伴随着ATCase四级结构的重大变化 思考题1、下列关于酶的别构调节，错误的是 A．受别构调节的酶称为别构酶 B．别构酶多是关键酶（如限速酶），催化的反应常是不可逆反应 C．别构酶催化的反应，其反应动力学是符合米-曼氏方程的 D．别构调节是快速调节 E．别构调节不引起酶的构型变化2、别构调节的特点是（ABCDE ）A. 别构剂与酶分子的非催化部位结合B. 使酶蛋白构象发生改变,从而改变酶的活性C. 酶分子多有调节亚基和催化亚基D. 是一种快速调节 E.别构酶常常是代谢途径的限速酶 思考题思考题3、、变构调节的特点是：（变构调节的特点是：（ ）） A、变构剂与酶分子上的非催化部位结合。
变构剂与酶分子上的非催化部位结合 B、使酶蛋白构象发生改变，从而改变酶活性使酶蛋白构象发生改变，从而改变酶活性 C、酶分子多有调节亚基和催化亚基酶分子多有调节亚基和催化亚基 D、变构调节都产生正效应，即加快反应速度变构调节都产生正效应，即加快反应速度 苏州大学苏州大学2008生物化学生物化学 思考题思考题5. 别构酶总是寡聚酶（判断）别构酶总是寡聚酶（判断）6．．抗体酶是水解抗体的酶的总称抗体酶是水解抗体的酶的总称判断判断））江南大学江南大学2010年生物化学年生物化学 7. 试从生物学进化的角度解释为什么生命体中存在大量的别构酶6分） 复旦大学2007年生物化学 思考题思考题10. 华南理工大学2006年 1) 下列关于别构酶的叙述，哪一项时错误的？下列关于别构酶的叙述，哪一项时错误的？( (单选单选) ) A. 所有别构酶都是多聚体，而且亚基数目往往是偶数 B. 别构酶除了活性部位外，还含有调节部位 C. 亚基与底物结合的亲和力因亚基构象不同而变化 D. 亚基构象改变时，要发生肽键断裂的反应 E. 酶构象改变后，酶活力可以升高也可以降低 2) 根据调节物分子不同，别构效应分别为______和______。
根据调节物使别构酶反应速度对[S]敏感性不同分为_____________和_______9，对于一个正协同效应别构酶当有激活剂（正调节物）存在下，其协同性（ ） A，减小；B，增加；C，不变 中国科学院中国科学院20052005年年 思考题思考题11、 有时别构酶的活性可以被低浓度的竞争性抑制剂激活， 请解释 江南大学2008年 思考题思考题12. 判断：米氏酶的Rs为81，正协同效应的别构酶Rs小于81，负协同效应的别构酶Rs大于81 厦门大学2006 年 （二）可逆的共价修饰的调控P424 1、定义 （1）共价修饰调节：酶蛋白分子中的某些基团可以在其他酶的催化下发生可逆的共价修饰,从而导致酶活性的改变,称为共价修饰. （2）共价调节酶（covalent regulatory enzyme） 是一类由其它酶对其结构进行可逆共价修饰，使其处于活性和非活性的互变状态，从而调节酶活性。
区分：共价催化Covalent catalysis 共价催化：酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物，此中间物易变成过渡态，反应活化能大大降低，提高反应速度 2、可逆共价修饰的类型l（1）磷酸化与脱磷酸化（最常见） 、Tyr、Ser、Thr、His；l（2）腺苷酰化和脱腺苷化接受修饰的氨基酸残基：Tyr；l（3）尿苷酰化和脱尿苷酰化 Tyr；l（4）ADP-核糖基化 Arg.Gln.Cys；l（5）甲基化和脱甲基化 Glul（6）乙酰化和脱乙酰化、例如（1）大肠杆菌谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化与脱腺苷 酰化发生在Tyr而失活 （2）糖原磷酸化酶磷酸化（丝氨酸）有活性 AT：：谷氨酰胺合成酶腺苷酰基转移酶谷氨酰胺合成酶腺苷酰基转移酶1. 谷氨酰氨合成酶是一种共价调节酶，它由12个亚基构成，在其它酶的作用下，它们受ATP转来的腺苷酰基的共价修饰后活性降低，或脱去腺苷酰基而调节该酶的活性后活性增高2.糖原磷酸化酶的共价调节 共价修饰调节糖原磷酸化酶的双重调节别构调节肌肉中caffeine 咖啡因（肝脏或肌肉中） 共价修饰调节的特点和意义 3 、共价修饰调节的特点： ⑴ 酶以两种不同修饰和不同活性的形式存在； ⑵ 有共价键的变化； ⑶ 一般为耗能过程（消耗ATP） ⑷ 受其他调节因素（如激素）的影响 ⑸ 存在放大效应4、化学修饰调节的生理意义 ⑴ 以调节代谢的强度为主，也调节速度。
⑵ 调节过程耗能少 ⑶ 代谢的方向调节速度快，节能，是体内调节经济有效的方式 级联放大效应糖原分解少少 5、化学修饰与别构调节的异同点别构调节共价修饰 相同点具有两种形式相互转变有构象变化 不 同 点共价键生成或断裂无有活性变化是否需要其他酶不需要需要级联放大效果无有构型改变无有作用区域胞内胞内和整体比较别构调节和化学修饰调节的异同及各自在代谢中的作用？2010年中科院生化与分子真题 1、变构调节的生理意义： ⑴ 调节代谢的速度速度和强度 ⑵ 调节代谢的方向，由分解改为合成，防止产物 过剩，使多余能源合成储存 ⑶ 调节能量代谢的平衡 化学修饰与别构调节的异同点2、化学修饰调节的生理意义 ⑴ 以调节代谢的强度强度为主，也调节速度 ⑵ 调节过程耗能少 ⑶ 代谢的方向调节速度快，节能，是体内调节经济有 效的方式 酶促化学修饰对酶活性的调节酶促化学修饰对酶活性的调节 五、酶原及酶原的激活1、定义 （1）酶原（zymogen）：有些酶在细胞内合成或初分泌时， 无活性前体形式，叫做酶原2）酶原的激活 ：从无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。
3）酶原激活的本质：酶原的激活实质上是酶活性 部位形成 或暴露的过程2、酶原激活特点：常伴有一级结构（构型）的改变 具有不可逆性P421 3、酶原与酶原激活的生理意义：酶原及酶原的激活 （1）、保护组织器官本身免受酶的水解破坏； （2）、保证酶在特定时空发挥催化作用； （3）、酶原可视作酶的储存形式4、举例：消化系统中的酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃 蛋白酶），血液凝固系统中的酶复习一下蛋白酶的 专一性）急性胰腺炎 自激活由胰蛋白酶激活课后课后12.试解释为什么胰凝乳蛋白不能像胰蛋白酶那样自我激活？胰凝乳蛋白酶原的激活（由胰蛋白酶激活） 胰蛋白酶原的激活 胰蛋白酶为什么可以自激活？胰蛋白酶中有多个赖氨酸，为何只剪切这一个？自激活？自激活？举例 * 带相同电荷的氨基酸残基连续出现连续出现在肽链上时，螺旋的稳定性降低 (如Lys，或Asp，或Glu)，不能形成稳定的α-螺旋如多聚Lys、多聚GlupH对蛋白质α-螺旋的影响 4. 胃蛋白酶的胃蛋白酶的激活过程激活过程 思考题思考题1. 南开大学南开大学2001生物化学 1） 在胰凝乳蛋白酶的催化过程中，活性中心Ser羟基的( ) 和His咪唑基的（ ） 作用起着重要作用。
2. 华东师范大学华东师范大学2005生物化学 胰凝乳蛋白酶专一水解多肽链中 （A）碱性氨基酸残基N端 （B）酸性氨基酸残基N瑞 （C）碱性氨基酸残基C端 （D）酸性氨基酸残基C端 （E）芳香族氨基酸残基C端3. 复旦大学复旦大学2004生物化学 胰凝乳蛋白酶能在＿＿＿、＿＿＿和＿＿＿的＿＿＿端切断肽键 思考题思考题4. 2003年中国科学院生物化学与分子生物学试题 下列哪种酶的巯基参与催化肽键断裂反应 A. 羧肽酶 A B.胃蛋白酶 C. 木瓜蛋白酶 D.胰凝乳蛋白酶5. 酶原激活的实质是 A. 激活剂与酶结合使酶激活 B. 酶蛋白的变构效应 C. 酶原分子一级结构发生改变从而形成或暴露出酶的活性中心 D. 酶原分子的空间构象发生了变化而一级结构不变 E. 以上都不对 华南理工大学华南理工大学20062006年年6. 酶刚合成时都以酶原形式存在。
判断） 华东师范大学华东师范大学20062006 六、同工酶 Isoenzyme or isozyme1、定义：能催化相同的化学反应，但存在多种四级缔合形式，并因而在物理、化学和免疫学方面都有差异的一组酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中，同工酶一般为寡聚酶，有两种或两种以上的亚基组成 乳酸脱氢酶（LDH）是1959年发现的第一个同工酶第一个同工酶 （1）结构：由4个亚基组成的寡聚酶，亚基分为M型和H型因此可以装配成5种四聚体：即LDH－－1（（H4））、LDH-2（H3M）、LDH－3（H2M2）、LDH-4（HM3）及LDH-5（（M4）），可用电泳方法将其分离脊椎动物心脏中主要是 LDH1，而骨骼肌的则是LDH5乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 心肌心肌: :LDH1乳酸乳酸 丙酮酸丙酮酸 LDH5骨骼肌骨骼肌: : 葡萄糖葡萄糖 + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 丙酮酸丙酮酸 + 2NADH + 2H+ + 2ATP + 2H2O 为什么丙酮酸还原为乳酸为什么丙酮酸还原为乳酸 ？思考：思考：生物氧化只有在氧存在才能进行吗生物氧化只有在氧存在才能进行吗 ？？糖异生氧化分解 乳酸循环(lactose cycle)过程葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖糖糖异异生生途途径径 丙酮酸丙酮酸 丙酮酸丙酮酸 乳酸乳酸 乳酸乳酸酵酵解解途途径径 糖异生活跃糖异生活跃有葡萄糖有葡萄糖- -6磷酸酶磷酸酶 糖异生低下糖异生低下没有葡萄糖没有葡萄糖- -6-磷酸酶磷酸酶 乳酸循环1、概念：肌收缩（尤其是氧供应不足时）通过糖酵解产生乳酸，因为肌肉内糖异生活性低，所以乳酸通过细胞膜弥散进入血液后，再入肝，在肝内异生为葡萄糖，葡萄糖入血后又可被肌肉摄取，这就构成了一个循环，成为乳酸循环，也叫Cori循环。
2. 生物学意义 （1）乳酸的在利用 （2）防止乳酸堆积造成酸中毒 为什么剧烈运动之后，会急促喘气 ？ 2011 年大连理工大学生物化学 lactose cycle急促喘气1.（是非判断题是非判断题） 肌肉剧烈收缩后产生大量乳酸，乳酸也可以在肌肉细胞中经糖异生而转化为葡萄糖，继而合成肌糖原厦门大学厦门大学2007年年中山大学中山大学20112011年年2. 正常情况下，（ ）是肌肉最理想的能量提供者 2、同工酶物理性质：（1）Aa组成和顺序不同（2）催化特性不同，对同一底物的Km值不 同，但活性部位相似（3）电泳行为不同（4）组织、器官中分布不同（5）生理功能不同physical properties may be different ie. charges, pI, solubility, size.kinetic properties may be different ie. Km, Vm, catalytic function, etc 3、生物学功能及临床意义在代谢调节上起着重要的作用，适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要；用于解释发育过程中阶段特有的代谢特征，和个体发育及组织分化密切相关；同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断；同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。
心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化1酶活性心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱2345 1、关于同工酶，哪些说明是正确的？、关于同工酶，哪些说明是正确的？ A、是由不同的亚基组成的多聚复合物是由不同的亚基组成的多聚复合物 B、对同一底物具有不同的、对同一底物具有不同的Km值 C、在电泳分离时它们的迁移率相同在电泳分离时它们的迁移率相同D、免疫学性质相同免疫学性质相同 苏州大学2008生物化学2. 同功酶催化相同的化学反应，它们的Km值也相同 华东师范大学2006年(判断题）3. 酶的化学修饰主要包括——、——、——和——等 复旦大学2007年生物化学思考题思考题 4．心肌损伤时，血清中哪种乳酸脱氢酶升高．心肌损伤时，血清中哪种乳酸脱氢酶升高 A. LDH1 B. LDH3 C. LDH4 D. LDH5 南开大学2006年生物化学思考题思考题5. 以乳酸脱氢酶为例说明同工酶的概念，并解释 其生理意义？ 20112011年中科院生化与分子年中科院生化与分子6. 什么是同工酶？用乳糖脱氢酶说明同工酶如何什么是同工酶？用乳糖脱氢酶说明同工酶如何 调节生理平衡？调节生理平衡？ 20112011年四川大学生物化学年四川大学生物化学 本章小结本章小结1. 酶的活性中心：概念、特点和研究方法酶的活性中心：概念、特点和研究方法2. 与酶催化高效性有关的因素（与酶催化高效性有关的因素（7 7条）和举例条）和举例3. 酶活性的调节（酶活性的调节（4 4种）种） 2.简要阐明胰 Rnase A 的活性部位如何确定？ 答：用化学修饰法研究 Rnase A 活性的必须氨基酸残基。
在 pH5.5 下，用等摩尔碘乙酸处理 RnaseA，羧甲基化的 His119 是主要产物，而羧甲基化的 His12 产物较少Rnase A 中其他组氨酸对这个试剂的反应弱得多所得 Rnase A 的两个羧甲基化的衍生物均无活性，因此可推测 His119 和 His12 为酶活性的必需集团2,4 二硝基氟苯可选择地同酶 LysεNH2反应，酶引起失活该结果表明 Lys41 也是酶活性部位的必需氨基酸以上研究结果可认为 His119、His12、Lys41 构成了 Rnase A 的活性部位课后题课后题 课后题课后题 9.胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因素引起这些差异？因素引起这些差异？ 答：相似之处：①执行相同的反应——裂解肽键；②其结构和作用机制很相似；③相对分子质量范围在 2.5×103 ， 并且具有相似的顺序和三级结构；④ 3 个极性残基——His57、Asp102 和 Ser195 在活性部位形成催化三联体。
不同之处：①专一性不同 思考题思考题1 1、一个二肽酶对二肽、一个二肽酶对二肽Ala-Gly和二肽和二肽Leu-Gly的的Km分别分别为为2.8×10-4和和3.5×10-2，哪一个二肽是酶的最适底物？，哪一个二肽是酶的最适底物？该酶的两个非竞争性抑制剂的该酶的两个非竞争性抑制剂的Ki值分别为值分别为5.7×10-2和和2.6×10-4哪一个是最强的抑制剂？哪一个是最强的抑制剂？<><>答：答：Ala-Gly是最适底物；是最适底物；Ki值最小的那个是最值最小的那个是最强的抑制剂强的抑制剂 2、（、（a））如果如果Km=2.9×10-4mol/L,Ki=2×10-5 mol/L, ,在底在底物浓度为物浓度为1.5×10-3mol/L时，要得到时，要得到75%的抑制需要竞争的抑制需要竞争性抑制剂的浓度是多少？性抑制剂的浓度是多少？ （（b））为了使速度达到原来为了使速度达到原来没有被抑制的数值，底物浓度必需增加多少？没有被抑制的数值，底物浓度必需增加多少？ 思考题思考题7、用、用 -淀粉酶水解可溶性淀粉，水解产物中的麦芽糖淀粉酶水解可溶性淀粉，水解产物中的麦芽糖 和和 -糊精均对该酶有抑制作用。
实验测得结果如下：糊精均对该酶有抑制作用实验测得结果如下： 底物浓度底物浓度[S]，，mg/ml 抑制剂浓度抑制剂浓度 11.5 5.76 2.88 1.44 抑制剂抑制剂 [I] mg/ml 相对水解速度（相对水解速度（v）） 无无 0.00 100 82 56 39 麦芽糖麦芽糖 6.35 90 77 50 36 12.70 82 66 46 31 25.40 67 57 38 27 -糊精糊精 1.67 100 78 49 32 3.34 100 76 45 28 6.68 100 70 37 23 求：求： -淀粉酶的淀粉酶的Km和和Vm；判断二种抑制剂的抑制类型；求二种抑制；判断二种抑制剂的抑制类型；求二种抑制剂的解离常数剂的解离常数Ki值。
值 思考题思考题8、、关于酶的共价修饰调节叙述中正确的是关于酶的共价修饰调节叙述中正确的是: : A.酶被其它小分子调节而无另外酶作用酶被其它小分子调节而无另外酶作用 B.调节过程无共价键改变调节过程无共价键改变 C.调节过程无级联放大效果调节过程无级联放大效果 D. .调节过程消耗调节过程消耗ATP, ,但经济有效但经济有效 E.常见的调节方式是甲基化及去甲基化常见的调节方式是甲基化及去甲基化 思考题思考题9、、已知丙氨酸是某酶的底物结合部位上的一个已知丙氨酸是某酶的底物结合部位上的一个氨基酸；一次突变丙氨酸转变为甘氨酸，但酶氨基酸；一次突变丙氨酸转变为甘氨酸，但酶活性没有受到影响在另一次突变时，丙氨酸活性没有受到影响在另一次突变时，丙氨酸变成了谷氨酸，使该酶的活性明显丧失，请分变成了谷氨酸，使该酶的活性明显丧失，请分析原因 答：因丙氨酸、甘氨酸都是中性氨基酸，且侧链较小，答：因丙氨酸、甘氨酸都是中性氨基酸，且侧链较小，而谷氨酸是酸性氨基酸，侧链较大；谷氨酸的酸性侧链而谷氨酸是酸性氨基酸，侧链较大；谷氨酸的酸性侧链可能使酶蛋白的构象发生改变，而导致酶活性的丧失；可能使酶蛋白的构象发生改变，而导致酶活性的丧失；或者是谷氨酸的酸性侧链于扰了酶与底物的结合。
或者是谷氨酸的酸性侧链于扰了酶与底物的结合 思考题思考题10、、从一级结构看，胰蛋白酶含有从一级结构看，胰蛋白酶含有13个个赖氨酸和赖氨酸和2个精个精氨酸，为什么胰蛋白酶不能水解自身？氨酸，为什么胰蛋白酶不能水解自身？答：因为胰蛋白酶分子的构象是高度折叠的，赖和精答：因为胰蛋白酶分子的构象是高度折叠的，赖和精氨酸被埋于分子内部，且远离酶的活性部位氨酸被埋于分子内部，且远离酶的活性部位11、、为什么胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶为什么胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和羧肽酶A都不能都不能水解脯氨酸参与形成的肽键（水解脯氨酸参与形成的肽键（一一X－－Pro－）？－）？答：因脯氨酸的环状结构，使它不能进入这些酶的答：因脯氨酸的环状结构，使它不能进入这些酶的底物结合部位底物结合部位 思考题思考题12、、胰凝乳蛋白酶的竞争性抑制剂是胰凝乳蛋白酶的竞争性抑制剂是ββ苯基丙酸盐，苯基丙酸盐，它可保护酶活性部位的组氨酸（它可保护酶活性部位的组氨酸（His57）不被烷基化修）不被烷基化修饰，而非竞争性抑制剂却不能，为什么？饰，而非竞争性抑制剂却不能，为什么？ 答：因竞争性抑制剂与亲和试剂答：因竞争性抑制剂与亲和试剂TPCK（（N一对甲一对甲苯磺酞苯丙氨酸氯甲基酮）都能与酶的活性部位结合。
苯磺酞苯丙氨酸氯甲基酮）都能与酶的活性部位结合这样，若竞争性抑制剂与酶的活性部位结合后，这样，若竞争性抑制剂与酶的活性部位结合后，TPCK就不能再与酶结合；而非竞争性抑制剂不能与酶的活就不能再与酶结合；而非竞争性抑制剂不能与酶的活性部位结合，因此它不能阻止性部位结合，因此它不能阻止TPCK与酶的结合与酶的结合。