PCR 技术的应用及其发展技术的应用及其发展王艺(哈师大 生科院,哈尔滨,150025)摘要:聚合酶链式（PCR）反应技术是一项新发展起来的技术,具有特异性强、快速、简便等很多优点.能在短时间内将所要的目的基因扩增至数万倍,扩增的】【5过程类似于 DNA 的复制过程,其特异性依赖于靶序列两端的寡核苷酸引物,并且可通过基因的扩增获得目的片段,广泛应用于产品的检测、病毒的检测、细菌的检测、亲自鉴定性别等都具有划时代的意义.本文就 PCR 的应用和目前的发展状况做一综述.关键字：PCR 技术；DNA；检测；应用；发展前言： PCR 技术是 20 实际 80 年代中期发展起来的体外核酸扩增技术,最初是为扩增已知序列设计的,打破了传统的 DNA 克隆方法,利用该技术能够从复杂的DNA 分子群体中选择性的复制一段特异的序列,使某一 DNA 片段得到特异性的扩增.PCR 技术有特异性高,灵敏度强,快速,简便等诸多优点,在生命科学飞速发展的今天,PCR 技术已经成为分子生物学中的常规技术.如今的 PCR 技术已经发展到一定的阶段,人们常用这个技术运用于食品工业,医学,病毒检测,生物学研究等方面.并且在这些方面也得到了良好的应用.1PCR 的原理PCR 技术是 1985 年美国 Cetus 公司发明的一种特异性的 DNA 体外扩增技术.首先合成两个小片段的寡核苷酸引物,长度一般在 20bp 左右,这两种引物分】【9别与需要扩增的 DNA 片段的正链和负链的两端互补,将引物片段与需要扩增的DNA 片段混合并加热使之变性,然后退火,这时引物片段和相应的 DNA 模板互补杂交,加入四种 dNTP 和 DNA 聚合酶进行 DNA 扩增,则完成了第一轮的循环,继之加热变性和退火,第一轮得到的 DNA 扩增链又作为第二轮扩增的模板再与引物杂交,进行第二轮扩增循环时犹豫引物和 dNTP 都是过量的,如果加入的 DNA多聚酶是耐高温的,则在以后各轮反应不需加入任何试剂直到达到需要扩增的量为止.运用此方法可正在短时间内得到大量的 DNA 扩增片段,数量可达数万倍,2PCR 技术的特性2.1操作简便应用 PCR 方法的早期阶段操作萦琐,因为使用的聚合醉是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的大片段,即 Klenow 片段,而不是耐高温的 TaqDNA 聚合酶,而且操作也未实现自动化.目前使用的是耐高温的 TaqDNA 聚合酶,其操作也实行了电脑控制的 DNA 扩增仪的自动化,只要将扩增反应所需要的特定程序输入 DNA 自动扩增仪,把反应所需要的全部材料混合均匀,置入仪器内,反应就会按照所输入的正确程序进行.如果需要,还可随时予以调整.2.2灵敏度高PCR 产物的生成,是以指数方式增加的,所以欲扩增 pg 量级的起始物到此水平成放大真核细胞单拷贝基因,通过 PCR 方法都是不难完成的.PCR 方法还可用单一双倍体细胞,一根头发,甚至单一精子进行 DNA 定型.3.3 特异性强作为引物的寡聚核昔酸与模板结合的正确性是决定反应产物是否特异的关键.TaqDNA 聚合酶耐高温的性质,使得反应中引物与模板退火的步骤可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的目的 DNA 片段也能保持很高的正确程度.3.4 对原始材料的质量要求低由于 PCR 技术有高灵敏度和较强的特异性,故仅含目的基因的 DNA,就可以作为反应起始材料来获取目的 DNA 扩增产物.4PCR 技术的应用4.1 PCR 在食品行业检测PCR 技术在食品科学中主要用于对食品中微生物含量的检测.众所周知,食品中微生物的检测涉及到人的健康,需要方便、准确、快捷的技术保障,传统方法检测食品中致病菌的步骤繁琐费时,需经富集培养、分离培养、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定以及必要的动物试验等过程,并且传统方法无法对那些难以人工培养的微生物进行检测.如肉制品的检验,蛋白质鉴定技术已成功运用于鉴别生鲜肉类的品种,但当食品中的肉类已经经过切碎、混合、蒸煮、熏烤等加工烹调过程后,失去了原有的形态学特征和质地.进攻处理也会改变肉类蛋白质的结构和稳定性,从而破坏物种特有的蛋白质和抗原决定部位.所以,蛋白质鉴定肉】【3类品种的稳定性和可靠性较差,已不能满足现代肉类安全检测的要求.随着生物技术的发展,A.A. Aida和 Y.B. Che Man使用 PCR 技术建立了检测清真食品10【】【11中是否含有猪肉或猪油的方法,物种特异性 PCR 技术可以用于清真食品的鉴定,是一种可以信赖和合适的技术.以物种间基因差异为基础的分子学鉴定方法成为研究的热点,而采用 PCR 方法有特异性强,灵敏度高和可鉴别性的特点,已经成为肉质品种鉴别最常用的方法.4.2 PCR 在医学中的应用在临床医学方面也经常使用 PCR 技术,如对乙肝病毒、肿瘤、病原体等的检测.如人类许多常见的肿瘤疾病与某些病毒病因及肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系.PCR 技术在肿瘤病毒病因、肿瘤相关基因、肿瘤相关抑癌基因等研究方面已取得可喜成果.同时也被用于多点突变的遗传病.]1[PCR 在法学中应用于亲子鉴定,血型鉴别,以及指纹鉴别等.如对痕量的血迹,无法用传统血清学的方法进行血型检验时,就可采用 PCR 方法检验 ABO 和 MN血型.对某些犯罪现场的生物材料的检定将为法医提供可靠有效的依据及直接、高效率的数据. DNA 技术鉴定进行取证主要应用在以下刑事民事案件中.】【64.3 PCR 在应用水中的检测1990 年,Bej et al在利用多重 PCR 的方法检测了 Leg-ionella 类菌种和大】【7肠类细菌 ,其结果是通过点对点方法固定的多聚 dT 尾捕捉探针和生物素标记的扩增 DNA 进行杂交来检测的.而对于水中得而大部分细菌,通常采用分离培养来鉴定它们弄得种类和数量,但是分离方法和培养基的选项额是限制检测效率的问题所在,使得一部分细菌由于不能在人工培养基上生长,使得鉴定的细菌种类和数量低于环境中的实际值.因此运用 PCR 技术可对水体进行直接检测,缩短】【2检测时间,扩大检测范围,并且具有较高的精确度.同时也可以反映水环境中微生物病原体的种类及多样性.4.4 PCR 技术在非生物学中的应用DNA 的初级结构核苷酸序列具有极丰富的信息含量,利用 PCR 扩增,可以从非常少的 DN A 原始材料中获取信息,使之在作为商业产品的亚显微标志或标志物方面用途广泛. 例如在对伪造产品的检测, 污染源的追踪调查等方面, 都可通过 PCR 来鉴定.】【4PCR 技术的问世成了生物学界的一个热点, 特别在分子生物学和人类遗传学等研究领域. 该技术能直接、富于针对性且高效率地提供数据, 还能得到离散的等位基因数据并正确地确定 DNA 类型的基因型. 此外, 还可用于遗传图谱构建、器官移植的组织类型鉴定, 检测转基因动植物中的植入基因等领域, 它使人类基因重组成为可能. PCR 的应用前景还使研究现已灭绝的动物及在过去几百年间收集的物种的群体遗传成为可能. 科学家们还在继续尝试扩增来自更稀有、更陌生样品的序列. 总之, PCR 作为一项“革命性的新技术”不仅推动分子生物学及相关学科的发展, 而且为相应的产业提供一片“天空”, 将在商业领域中占有重要领地.5 PCR 技术的发展PCR 技术创立之初,使用的 DNA 聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Kloonw大片段,它有两个缺点:一是大于 59℃时完全失活,需在每轮反应中添加新酶;二是催化反应须在 73℃下进行,模板与引物间的碱基错配效高,即特异性较差.近几年PCR 技术又在引物设计,使用标记等方面取得了一系列引人注目的新进展.PCR 作为一项“革命性的技术”,不仅推动了遗传与分子生物学的发展,而且在其它领域科学家的努力与创新下,其不断与该领域的核心技术相结合,极大地推动了此领域的发展.并且 PCR 技术从问世便成为生物学界的一大热点.传统 PCR 技术以及衍生出来的新型 PCR 技术自面世以来,已被广泛应用到生命科学的各个领域.随着技术方法的不断改进与完善,荧光定量 PCR 技术将会逐渐完善并广泛应用.多重 PCR 技术在食品病原微生物、非致病微生物及环境微生物检测中的应用；PCR 技术在食品、医学、以及其他方面的应用都具有重要的作用.在高通量的生物免疫检测方面具有广泛的应用.未来的研究主要集】【8中在去除食品抑制因子干扰改进样品前处理技术等方面,其次是整合应用多重 PCR 与其他技术,必将在未来食品微生物检测中有非常好的应用前景.参考文献【1】 陈尚武.不同种类的 PCR 技术及其应用[J].贵阳医学院校报．1993.14(3);113-116【2】 丁清波 戴 浩 吴敬波 方东明. FQ-PCR 技术在饮用水生物学监测中的应用. 黑龙江环境通报. 2009.12(4).【3】 刘帅帅，李宏，罗世芝，刘云国. PCR 技术在肉类掺假检验中的应用进展. 食品安全质量检测学报. 2011,12(6)【4】 刘怀如, 张桂萍. PCR 技术的应用及前景展望. 泉州师专学报( 自然科学). 1999.11(6).【5】 王华, 刘斌. PCR 技术在食品微生物检测中的应用. 生物技术通报. 2010.(2)【6】 赵铁军,贾天军,王德宝.DNA 检验在法医学中的应用及发展[J].张家口医学院学报,2003(5):64～68.【7】 谢海燕. 黑线仓鼠 LHR 部分序列克隆及组织器官的表达差异[D].曲阜：曲阜师范大学，2011.【8】 林虹君，张爱红，蔡耘，等. 电感偶合等离子体质谱(ICP-MS)在蛋白质绝对定量中的应用[J]. 生命的化学，2009,9:153-157.【9】 常世敏.PCR 在食品微生物检测中的应用[J].邯郸农业高等专科学校学报，2004，21（4）：23-25.【10】AIDA A A，CHE MAN Y B，WONG C M V L，et al．Analysis of raw meats and fats of pigs using polymer-ase chain reaction for Halal authentication ［J］ ． MeatScience，2005，69( 1) : 47-52．【11】Y B CHE MAN，A A AIAD，A R RAHA，et al． Iden-tification of pork derivatives in food products by spe-cies-specific polymerase chain reaction ( PCR) forhalal verification［J］ ． Food Control，2007，18 ( 7) :885-889．。