新型抗菌自修复自粘接树脂水门汀的制备及抗菌性能探讨自粘接树脂水门汀可以直接与牙本质产生有效结合,高效、方便的特点使其在临床上备受青睐,被广泛地应用到桩核、嵌体、冠、桥等间接修复体的粘接[1]尽管其性能不断改进,树脂-牙本质粘接界面仍然是薄弱环节[2],在复杂的口腔环境中会出现界面继发龋、微裂纹等,最终导致粘接失效因此,研发具有抗菌及自我修复微裂纹性能的新型树脂水门汀势在必行对于抗菌而言,本课题组前期创新制备了表面接枝长链烷基季铵盐的纳米二氧化硅抗菌无机填料[3],并开展了应用于复合树脂[3]、树脂粘接剂[4]等一系列的研究对于预防微裂纹而言,本课题组前期研究[5]首次成功合成了含牙科单体三乙二醇二甲基丙烯酸酯的微胶囊,并将一定量的微胶囊加入自行合成的自粘接树脂水门汀中,使其具有自我“感知”并修复微裂纹的功能[6]上述研究[3,4,5,6]为研发兼具抗菌及自修复双重功能的自粘接树脂水门汀奠定了坚实的基础,对于具有自修复功能的自粘接树脂水门汀而言,作为后续研究,抗菌填料的加入对其粘接强度及抗菌性能等方面的影响是接下来需要重点关注的因此,本课题在前期工作的基础上,拟将新型抗菌填料添加到具有一定量微胶囊的自粘接树脂水门汀中,并探讨其相关性能,为其进一步的临床应用提供实验依据。
1、材料和方法1.1实验材料及设备纯度99.99%,平均粒径20nm的M5型纳米二氧化硅(Cabot公司,美国),二甲基十八烷基[3-(三甲氧基硅基)丙基]氯化铵(广州爱谱化工有限公司),γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(成都晨邦化工有限公司),双酚-A-二甲基丙烯酸缩水甘油酯、三乙二醇二甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰氧乙基偏苯三酸酐酯、N,N-二羟乙基对甲苯胺、苯基双(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、过氧苯甲酰、乙烯马来酸酐共聚物、尿素、氯化铵、间苯二酚及37%甲醛水溶液(Sigma-Aldrich公司,美国),主体成分是铝硅酸钡颗粒并经过表面偶联处理,平均粒径2µm的无机填料(Dentsply公司,美国)长50mm、直径7.8mm的磁力搅拌子及水浴加热装置(Fisher公司,美国),Triad2000型光固化灯(Dentsply公司,美国),5500R型万能力学测试机(Cary公司,美国),TE2000-S型光学显微镜(Nikon公司,日本),Quanta200型扫描电子显微镜(FEI公司,荷兰)1.2含碘代长链烷基季铵盐的新型纳米抗菌无机填料的制备及表面偶联化处理[3]1.2.1十八烷基二甲基(γ-三甲氧基硅基丙基)碘化铵的制备将十八烷基二甲基(γ-三甲氧基硅基丙基)氯化铵、碘化钾按照摩尔比1︰1.1加入装有温度计、磁力搅拌棒、冷凝装置、氮气密封的四口烧瓶中,以无水乙醇作为溶剂,加热至回流1～2h,真空抽滤,滤饼用无水乙醇洗涤,滤液减压浓缩,脱除溶剂得到淡黄色粘稠的碘代长链烷基季铵盐液体。
1.2.2新型纳米抗菌无机填料的制备填料制备按照每0.05mol的季铵盐和3g纳米二氧化硅的比例,将十八烷基二甲基(γ-三甲氧基硅基丙基)碘化铵与纳米二氧化硅及无水乙醇加入装有温度计、磁力搅拌棒、冷凝装置的四口烧瓶中,氮气置换,并在氮气保护下加热搅拌回流反应6h反应结束后过滤,滤饼用滤纸包好,放入索氏抽提器中,用无水乙醇萃取24h,取出烘干,得到碘代季铵盐修饰纳米二氧化硅颗粒1.2.3新型纳米抗菌无机填料的表面偶联处理将0.2gγ-MPS和10g抗菌填料加入三口瓶中,再加入50mL无水乙醇及1mL蒸馏水,滴加冰乙酸调节pH值至3.0左右,磁力搅拌2h,过滤,滤饼用无水乙醇反复滤洗,滤饼60℃干燥,得到表面偶联化处理的纳米抗菌无机填料1.3微胶囊的合成采用原位聚合法合成本研究所用的微胶囊,简要过程如下[6]:取30mLTEGDMA,并加入质量百分比为1%的还原剂DHEPT,混匀备用室温下,将50mL蒸馏水和13mL2.5%EMA水溶液(表面活性剂)加入平底烧瓶中,烧瓶悬置于水浴加热装置中,磁力搅拌(300r·min-1)作用下,加入1.25g尿素、0.125g间苯二酚及0.125g氯化铵(催化剂),调节反应体系pH=3.5。
之后,将搅拌速度提高至900r·min-1,缓慢加入30mL的TEGDMA-DHEPT油相液体,继续磁力搅拌10min,形成稳定的水包油型乳化溶液然后逐滴加入3.15g37%的甲醛水溶液,烧瓶用锡箔纸封口,将水浴的温度缓慢上升至55℃,磁力搅拌(900r·min-1)下继续反应4h,反应结束后,将含有微胶囊的悬浮液缓慢冷却至室温,蒸馏水滤洗,滤饼通风橱内干燥24h,得到白色微胶囊取适量微胶囊,蒸馏水分散后光学显微镜测量平均粒径(测量200例);另取适量微胶囊,SEM观测微观形貌1.4新型抗菌自修复自粘接树脂水门汀的制备本课题组前期成功制备了自修复自粘接树脂水门汀[6],其基本组分为:40%树脂基质(Bis-GMA和TEGDMA按照质量比1︰1构成)+50%2µm常规无机填料+5%4-META(酸性功能单体);微胶囊则以质量百分比7.5%添加;同时加入1%的光敏剂BAPO、1%的氧化剂BPO及0.5%的还原剂DHEPT(均为质量百分比),形成双固化引发体系(过量的BPO还与囊液中的还原剂DHEPT组成氧化-还原反应体系,引发释放出的自修复单体TEGDMA固化)在避光的条件下,将上述各组份混合均匀,手工调拌,生成母体糊状自修复自粘接树脂水门汀,并分为A(含有光敏剂、氧化剂)、B(含有还原剂)两部分。
在自修复自粘接树脂水门汀的基础上,为探讨不同比例的新型纳米抗菌无机填料对其影响,在保证50%无机填料总量不变的前提下,按照总质量的0(50%常规无机填料)、2.5%(2.5%抗菌填料+47.5%常规无机填料)、5.0%(5%抗菌填料+45%常规无机填料)、7.5%(7.5%抗菌填料+42.5%常规无机填料)和10.0%(10%抗菌填料+40%常规无机填料)的比例添加,分成5组,分装后备用,以上均为质量百分比1.5粘接强度的测试采用剪切法进行牙本质-树脂粘接强度的测试选择新鲜拔除的人(前)磨牙30颗,要求无龋、无裂纹及缺损自凝塑料固定牙根于包埋磨具中,高速涡轮机+金刚砂车针在喷水降温下,自釉牙骨质交界处上方2mm处切除冠部牙体组织,充分暴露牙本质再采用400、600、800目的水砂纸逐级打磨牙本质各10s,超声清洗5min,得到标准的牙本质粘接面然后将预制直径为3mm圆孔的双面胶带纸粘于牙本质粘接面上,并确保牙本质粘接面未受污染且避免过度干燥(保持适度潮湿),然后固定内径4mm、高2mm的预制铜环于带圆孔的双面胶上,使铜环的中心与圆孔的中心一致,铜圈外周用凡士林封闭取等量A、B两组分树脂水门汀手工混匀,然后沿铜环内壁缓慢充填自粘接树脂水门汀至铜环等高,光照固化40s,1h后将试件贮存于37℃蒸馏水中24h后待测(每组6个试件)。
将试件通过自制夹具固定于万能材料试验机上,加载头与粘接面平行,下降速度0.5mm·min-1,加载点位于铜环上距粘接界面0.5mm处,直至粘接失败,计算粘接强度[6,7]1.6力学性能的测试1.6.1采用三点弯曲法测试试件的弯曲力学性能取特制的内腔尺寸为2mm×2mm×25mm的可分卸金属磨具,充填上述调和后的树脂水门汀(A、B双组分),充满后上下覆盖聚脂薄膜带后再覆盖载玻片,压实,光照固化40s,1h后取出试件,用细砂纸轻轻打磨掉飞边,置于37℃蒸馏水浸泡24h待测(每组10个试件)将待测复合树脂试件置于万能力学测试机加载平台上,加载条件为:加载速度1mm·min-1,跨距10mm,直至树脂试件碎裂计算试件的弯曲强度(S)和弹性模量(E)[4]1.6.2采用单刃V形切口梁法测试试件的断裂韧度同样方法制备2mm×2mm×25mm的长条形树脂试件于树脂试件底部用ST300-10P型刀片(DORCO公司,韩国)锯开深约500μm的平行于加载方向的裂痕,而后更换新的刀片并粘取粒径3μm的金刚砂抛光膏继续将裂痕小心切削至深700～800μm,宽约20μm,金相显微镜下分别测量试件裂痕两侧的深度,取其均值作为裂痕的最终深度。
置于37℃蒸馏水浸泡24h待测(每组6个试件)将待测复合树脂试件置于万能测试机加载平台上,加载头精确对准裂痕,加载条件为:加载速度0.5mm·min-1,跨距10mm,直至树脂试件断裂,计算试件的断裂韧度(KIC-virgin)[6]1.7自修复效率的检测为更好地模拟临床上口腔内树脂水门汀粘接固化后发生微裂纹的实际情况,将上述折裂为2段的树脂试件片迅速准确复位至相对应的可分卸金属磨具中,并确保两断端结合紧密,上下覆盖载玻片,夹子夹紧,试件置于37℃的潮湿恒温箱中,自修复24h[5]然后小心取出自修复后的树脂试件,光学显微镜下再次测量裂痕的长度,确保与自修复前的裂痕长度一致,而后同样的方法测试断裂韧度,得到自修复后的断裂韧度KIC-healed自修复效率(η)的计算公式为[6]:η=KIC-healed/KIC-virgin1.8抗菌性能的测试取96孔板的上盖,将树脂水门汀充满盖内的圆形凹槽,上覆条状聚脂薄膜带,轻轻压平,光固化后小心分离,生成厚度为1mm、直径为8mm的圆盘状树脂片,每组6个试件,环氧乙烷消毒后备用根据研究[4]的方法,继续采用封闭式的体外人牙菌斑生物膜培养模型作为研究对象,进行抗菌性能的检测。
该模型基于24孔板,通过48h的连续厌氧培养后,在树脂水门汀试件表面获得成熟稳定的体外人牙菌斑生物膜而后进行人牙菌斑生物膜菌落形成单位(colony-formingunit,CFU)计数、乳酸脱氢酶法检测人牙菌斑生物膜乳酸产量等测试[4]1.9统计学分析选用SPSS19.0统计学软件对测试结果进行单因素方差分析,并选用SNK法进行两两比较,检验水准设定为α=0.052、结果2.1光学显微镜及SEM观测结果经光学显微镜观测测量,微胶囊粒径略有不同,平均粒径为(24±11)μmSEM照片见图1,微胶囊呈圆球形,囊壁表面粗糙,附着有很多细小颗粒图1微胶囊SEM照片×10002.2粘接强度测试结果各组试件粘接强度测试结果如表1所示添加质量百分比为5.0%的抗菌无机填料对粘接强度没有影响(P>0.1);而当抗菌填料质量百分比超过7.5%时,粘接强度下降明显(P<0.05)表1粘接强度、弯曲强度及弹性模量测试结果2.3力学性能测试结果1)各组试件的弯曲强度以及弹性模量的测试结果如表1所示各组之间三点弯曲强度以及弹性模量无明显的差别,这说明,加入一定量的抗菌无机填料对树脂水门汀的基本弯曲等力学性能没有影响(P>0.1)。
2)各组试件原始断裂韧度及自修复后断裂韧度如表2所示与基本弯曲力学性能测试结果类似,向树脂水门汀中加入抗菌无机填料不会降低其断裂韧度(P>0.1)表2断裂韧度及自修复效率测试结果2.4自修复效率测试结果如表2所示,不同组别的自修复效率没有差别(P>0.1),证实抗菌填料的加入没有影响新型树脂水门汀的自修复性能2.5抗菌性能测试结果各组试件的CFU计数和乳酸代谢测试结果见表3与对照组相比,添加2.5%的抗菌无机填料就能使菌斑生物膜中的细菌数量呈数量级减少(P<0.05),说明新型树脂水门汀有较强的抗菌性当抗菌填料质量分数为2.5%及以上时,各实验组的乳酸产生量约为对照组的1%,表明新型抗菌自修复树脂水门汀可以显著抑制人牙菌斑生物膜中的乳酸产生量(P<0.05)表3各组树脂粘接剂的CFU计数和乳酸代谢检测结果3、讨论自修复材料是一类能够模仿生命系统自修复特性,具有感知和激励双重功能的材料,材料一旦产生缺陷,在无外界作用的条件下能够自我修复利用微胶囊技术是制备自修复智。