第七章 革兰阴性球菌李向阳 奈瑟菌属（Neisseria）布兰汉菌属（Branhamella）概述n“伯杰鉴定细菌学手册”第9版n将奈瑟菌属和布兰汉菌属归于群4，将奈瑟菌属、莫拉菌属、金氏菌属和不动杆菌属都归于奈瑟菌科n奈瑟菌属中的淋病奈瑟菌（N.gonorrhoeae）、脑膜炎 奈瑟菌（N.meningitidis）以及莫拉菌属中的卡他莫拉 菌（M.catarrhalis）是主要的致病菌n目前对卡他莫拉菌是归属尚未定论一、分类n淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌对人致病n寄生在人体内鼻咽腔的腐生菌n解乳糖奈瑟菌、干燥奈瑟菌、微黄奈瑟菌、粘液奈瑟菌、浅黄奈瑟菌、灰色奈瑟菌、延长奈瑟菌、去氮奈瑟菌和多糖奈瑟菌第一节 奈瑟菌属二、脑膜炎奈瑟菌临床意义n寄居于人的鼻咽腔、口腔粘膜上，通过呼吸道分泌物或空气微滴核而传播n流行性脑脊髓膜炎n冬末春初，多为学龄儿童、青少年n感染后多为隐性感染，少数可发展为菌血症或败 血症，进而累及脑、脊髓膜，形成化脓性脑膜炎n可出现严重的临床症状如发热、头痛、脑膜刺激症阳性、甚至休克和DIC等；菌血症和细菌的损伤作用使约半数患者出现皮下瘀斑脑膜炎奈瑟菌临床意义n尽管可以在鼻咽部形成带菌状态，但侵袭性 的脑膜炎奈瑟菌感染多为新近感染，急性发 病，发病时机体内缺乏杀菌抗体。
n主要致病物质是脂多糖n依据荚膜多糖的抗原成分可分为：A、B、C 、……等13个血清群，我国A群占95.8%，其 余为B、C等群淋病奈瑟菌临床意义n淋病的病原菌n主要通过性接触直接感染n在分娩时通过产道感染新生儿n临床表现为：n单纯性淋病n盆腔炎口咽部和肛门直肠淋病n淋菌性结膜炎n播散性淋病n致病物质包括菌毛、外膜蛋白、蛋白水解酶、脂多糖和铁调节蛋白1．形态n革兰阴性双球菌n直径0.6~1.5μm形似双肾或咖啡豆样 ，凹面相对n无动力，无芽胞，某些菌种形成荚膜三、生物学特性2．培养特性n需在培养基中添加羊血、兔血或血清，对脂肪酸敏感，在培养基中需加入可溶性淀粉n需氧生长，初次分离需5%~7%CO2和高湿度n最适生长温度为35~37℃，低于30℃不生长n血琼脂平板或巧克力琼脂平板上呈光滑、湿润、透明或半透明、直径1~2mm的不溶血、圆形、灰 兰色菌落n卵黄琼脂平板上为无色、光滑、湿润奶油状菌落n在液体培养基中呈轻度或中度混浊生长，无菌膜n脑膜炎奈瑟菌于孵育24h后在培养基上发生自溶3．生化特性n氧化酶阳性，触酶阳性（除延长奈瑟菌外 ）n对糖分解能力、硝酸盐还原能力和DNA合 成酶不同，常作为菌种间的鉴别依据n奈瑟菌属DNA中G+Cmol%为46~544．抵抗力n对寒冷、干燥和热的抵抗力弱，对化学消 毒剂敏感n对青霉素敏感n但近年来由质粒介导的β内酰胺酶所致的耐药在淋病奈瑟菌中产生较多四、微生物检验脑膜炎奈瑟菌n标本采集n 无菌方法抽取脑脊液、关节液、血液、瘀点穿 刺液等标本n采集后立即送往实验室n用血平板进行床边接种后置35℃孵育n血液标本接种在血液培养瓶中置35℃孵育n标本运送时需要35℃保温标本直接检查n直接涂片检查n脑脊液直接或经离心后取沉淀涂片n皮肤瘀点渗出液涂片n革兰染色后显微镜下见白细胞内外的革兰阴性双球 菌，可报告“检出革兰阴性双球菌，疑似脑膜炎奈瑟 菌”。
有助于流行性脑脊髓膜炎早期诊断n抗原检查n通常用胶乳凝集试验和其他凝集试验n包括A、C、Y、W125血清型的多价抗体和血清型B抗体n检测结果应结合涂片和培养结果，抗原检测阳性结 果可作出快速、推测性诊断分离培养鉴定 n脑脊液标本n接种在巧克力琼脂或羊血琼脂平板n咽拭子或鼻咽拭子n接种在选择性培养基上如改良的Thayer-Martin(MTM)、 GC-Lect、New York City(NCY)等培养基n血液标本n经增菌培养基增菌培养后，移种至巧克力琼脂或羊血琼脂 平板上n置5%~7%CO2 35℃孵育，每隔24h观察平板鉴定n初步确定为奈瑟菌属n直径1~2mm，灰褐色、光滑、半透明、稍扁的菌落n涂片革兰染色见阴性双球菌n氧化酶试验阳性n进一步进行葡萄糖和麦芽糖发酵试验阳性、其他糖类发酵阴性可确定为脑膜炎奈瑟菌n用分型血清确定血清型别n平板上没有发现菌落需继续观察72h后无菌生长可报告为阴性（二）淋病奈瑟菌 1．检验程序2．标本采集 n阴道和宫颈分泌物n用无菌塑料棒涤纶拭子，伸入阴道后穹隆或宫颈内1cm处停留10~15秒时间，蘸取n采集尿道分泌物n弃去前段脓性分泌物，留取后段作为标本n尿液n直肠肛拭标本n废弃第一根污染棉签，用第二根棉签醮取的分泌物n新生儿结膜炎时应采取眼结膜表面分泌物3．标本直接检查n标本采集后应立即涂片、革兰染色、显微镜检查n男性尿道分泌物标本中可见中性多形核细胞内、外较多革兰阴性双球菌，有助于男性淋病早期诊断n女性宫颈或直肠拭子标本涂片中可见胞内、胞外大量革兰阴性双球菌，由于女性阴道和直肠有许多正常菌群寄居，故对涂片所见结果必须由培养结果得以证实方可报告n新生儿结膜分泌物可见胞内、胞外大量革兰阴性双 球菌可初步诊断为淋球菌性结膜炎4．分离培养与鉴定n选择培养基如MTM，Martin-Lewis（ML） ，或NYCn置于5%CO2气体条件下35~37℃孵育n每隔24h观察平板（1）形态和生化学鉴定n可疑菌落n直径0.5~1mm，灰褐色、光滑、半透明呈露滴 状凸起的菌落n确认n将菌落涂片，革兰染色见革兰阴性双球菌n氧化酶和触酶试验阳性n葡萄糖发酵试验阳性，其它糖类阴性n培养需观察72h后无菌生长可报告为阴性。
2）免疫学鉴定n直接荧光染色n凝集试验或免疫渗滤技术（3）分子生物学鉴定n检测靶片段的基因n隐蔽性质粒、染色体基因探针、抗淋病奈瑟菌胞嘧啶DNA 甲基转移酶基因、透明蛋白(opa)基因、菌毛DNA 探针、rRNA 基因探针和porA 假基因n基因探针杂交、核酸扩增第二节 卡他莫拉菌n卡他莫拉菌（M.catarrhalis）又称为卡他布 兰汉菌（Branhamaceae catarrhalis）n可存在于健康人群的上呼吸道n近十年来报道n导致中耳炎、鼻窦炎、慢性阻塞性肺炎n在免疫抑制和ICU的患者可导致菌血症n是社区呼吸道感染的主要病原体之一 临床分离n从中耳炎或鼻窦炎患者穿刺抽取标本n呼吸道感染患者应采取合格痰标本或支气管灌洗液n口咽部位存在卡他莫拉菌可污染痰液标本n痰液标本直接涂片革兰染色n如出现多个中性粒细胞、柱状上皮细胞以及大量的直径为 0.5~1.5μm革兰阴性双球菌可怀疑卡他莫拉菌感染卡他莫拉菌培养及鉴定n在血液琼脂或巧克力琼脂平板上生长良好n35℃ 24h孵育后菌落直径1~3mm，灰白色、光滑，用接种环推菌落可将整个菌落在平板表面移动n氧化酶和触酶阳性n不发酵葡萄糖和其它糖类产酸n大多数菌株还原硝酸盐和产生DNase。
n三丁酸甘油酯水解（丁酸酯酶）试验阳性可与奈 瑟菌属鉴别n可产生诱导型β内酰胺酶 奈瑟菌属和卡他布兰汉菌的鉴定。