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1、,三、固相载体 （一）固相载体的要求 理想的固相载体应与抗体（抗原）有较高的结合容量，且结合稳定极少脱落；它可结合抗原或抗体免疫反应物，以及如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白质；生物大分子固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液；固相化方法应简便易行、快速经济。,,（二） 固相载体的种类和选择 .塑料制品 抗体或蛋白质抗原可通过非共价或物理吸附机制结合到固相载体表面。因材料经济、方法简便、操作及测定易于自动化，迄今用聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板仍是异相酶免疫测定方法最常用的固相载体。,,.微颗粒 此类固相载体系由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为
2、微米（m），由于带有能与蛋白质结合功能团（如NH2、COOH、OH、CHO或NHNH2等），易与抗体（抗原）形成化学偶联，且结合容量大。 .膜载体 包括硝酸纤维素膜（nitrocellulose，NC）玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。,,四、免疫吸附剂 免疫吸附剂是指与固相载体结合的抗原或抗体，而将抗原或抗体固相化的过程称为包被（coating）。包被的方法依所用固相载体种类而有不同，可以是非共价键吸附，也可是共价键化学偶联。目前普遍使用的聚苯乙烯固相载体（如 ELISA板）即多采用吸附方式包被抗原或抗体。除固相载体的理化性质外。,,用抗原或抗体包被后，固相载体表面常余少量未吸附位点，可非特异
3、地吸附测定时加入的标本和酶标记物中的蛋白质，导致本底偏高。因此需用15牛血清白蛋白或520小牛血清等包被一次，消除上述干扰，此过程称为封闭（blocking）。包被好的固相载体，加防腐缓冲液在低温可放置一段时间而不丧失免疫活性。,,第二节 酶免疫技术的分类 酶免疫技术是利用酶的高效催化和放大作用与特异性抗原抗体反应相结合而建立的一种标记免疫技术。由于是用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应，因此酶免疫技术一般由二部组成：首先是抗原、抗体之间的一次或数次免疫学反应形成复合物；然后加入酶作用底物，酶标抗原或抗体中的酶即催化其发生呈色反应，而产物的色泽程度与抗原抗体复合物中酶标记物的酶活性相关，因
4、此可以通过测定酶活性来确定待检抗原或抗体的存在或含量。酶免疫技术按实际用途分为酶免疫测定（encymeimmunoassay，EIA）和酶免疫组化两大类。,,（一）异相液相酶免疫测定 此类测定方法主要用于检测样品中极微量的短肽激素和某些药物等小分子半抗原，近年来的发展使其灵敏度可达ng至pg水平，与放射免疫测定相近。但因酶标记物具更好的稳定性，已无放射性污染，故近年有取代放射免疫测定的趋势。,异相酶免疫测定,,（二）固相酶免疫测定 固相酶免疫测定（solid phase enzymeimmunoassay，SPEIA），是利用固相支持物作载体预先吸附抗原或抗体，使测定时的免疫反应在其表面进行并
5、形成抗原抗体复合物，洗弃反应液中无关物质并加入酶底物后，通过测定固相载体上的酶标记物催化底物生成的有色产物，确定样品中抗原或抗体的含量。目前应用最广泛的是以聚苯乙烯等材料作固相载体的酶联免疫吸附试验（ELISA）。,,第三节 酶联免疫吸附试验 一、基本原理 酶联免疫吸附试验（ELISA）于1971年分别由瑞典学者Engrall和Perlmann，荷兰学者VanWeeman和Schuurs报道。它开创了运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法。其基本原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；,,测定时，将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一
6、定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）即与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例；经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物即被固相载体上的酶催化变为有色产物，最后通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中被测物质含量。,,二、方法类型及反应原理 1、双抗体夹心法 双抗体夹心法，属非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。 其基本工作原理是利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体可分别与样品中被检测抗原分子上两个不同抗原决定簇
7、结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。,,,2、间接法 此法是测定抗体最常用的方法，属非竞争结合试验。其原理是将抗原联接到固相载体上，样品中待检抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗（针对受检抗体的抗体，如羊抗人IgG抗体）与固相免疫复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待检抗体含量（图10-5）。,,,间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子（如抗人IgG），因此该法只需变换固相抗原，即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性。,,3、竞争法 竞争法ELISA可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定，其方法学特点是： 酶标记抗原（抗体）与样品或标准品中的非标记抗原或抗体具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力； 反应体系中，固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记与非标记抗原（抗体）的分子数量和； 免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原（抗体）的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原（抗体）的浓度成反比。,,,4 捕获法 捕获法（亦称反向间接法）ELISA，主要用于血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。 5 其他ELISA,
