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1、,干细胞研究进展 组胚：郭雨霁,1981年Evans等成功地建立了小鼠的ESC系； 1995年Thompson等建立了第一株灵长类动物的ESC系； 1998年11月，美国威斯康星大学的科学家在美国科学杂志报告说，他们已成功地使人类胚胎干细胞在体外生长和增殖； 1999年12月，干细胞研究进展被科学杂志评选为该年度世界十大科学进展之首; 1999年12月，美国科学家在美国科学院院刊报告说，小鼠肌肉组织的成体干细胞可以“横向分化”为血液细胞。随后，世界各国的科学家相继证实，成体干细胞，包括人类的成体干细胞具有可塑性; 2001年末,干细胞研究又被其列为六大热门科技领域之首;,干细胞的话题沸沸扬扬地
2、充斥在全球各种新闻媒体,2001年4月，美国科学家发现，从病人臀部和大腿处抽取的脂肪中，含有大量类似干细胞的细胞，这些细胞可以发育成健康的软骨和肌肉等。 2006年两项研究成果标志着干细胞技术正从一种概念，转变成能够看得见的事实： 美国科学家利用胚胎干细胞所衍生的运动神经元让瘫痪的老鼠恢复了行走能力； 英国科学家从胚胎干细胞中培育出来的精子，并使之与卵细胞结合，生育出幼鼠。 2010年1月韩国朝鲜日报报道，韩国建国大学兽医学院教授利用人类脐带血干细胞成功治愈了脊髓受伤导致两条后腿瘫痪的狗。 分离和体外培养各种来源的干细胞的技术不断成熟,更是引发了新一轮的干细胞研究热潮。 美国加州每年提供干细胞
3、研究经费达3亿美元。我国的干细胞研究也很活跃，“863”计划近期将为干细胞研究提供2亿元人民币的经费。2000年日本启动“千年世纪工程”，干细胞工程为核心技术的再生医疗成为这项工程的四大重点之一，第一年度投资金额达108亿日元。,到底干细胞是什么东西，为何会受到如此的关注？ 干细胞是潜力无穷？还是被我们过度期待？,干细胞（stem cells） 是一类能够进行自我更新（self-renew）和尚未分化 （un-differentiated具有分化潜能）的细胞； 可以分化为多种组成人体的组织或器官的细胞类型。,自然存在的各种干细胞,多能(pluripotent)干细胞 (胚胎干细胞、胚胎生殖细胞
4、),单能(unipotent)干细胞,(成体干细胞),造血干细胞,其他组织特异性干细胞 （神经、肺部干细胞等）,特化细胞,红细胞,血小板,白细胞,全能(totipotent)干细胞 (受精卵),The fertilized ovum is the origin of the life.,卵黄囊尾侧壁上的内胚层细胞是原始生殖细胞的发源地。 后经肠系膜迁移至生殖腺嵴。,多能干细胞pluripotent stem cells： a、来源：胚胎干细胞内细胞群细胞 胚胎生殖细胞原始生殖细胞 b、特点：可进行克隆性增殖而不发生分化，保持二 倍体核型不变； 具有多向分化的潜能，在特定条件下可诱 导分化为三个
5、 胚层来源的所有组织细胞； 失去了发育形成生物个体的能力。 c、多分化潜能性的实验证据：嵌合体实验 畸胎瘤实验 类胚体实验,单能干细胞unipotent stem cells： 成体干细胞/组织特异性干细胞 a、特征：能自我复制,有分化潜能,但只能分化为所在 组织的功能细胞。 b、存在部位：骨髓,周围血液,脑,脊髓,血管,骨骼肌,表皮, 消化管,角膜,视网膜,肝,胰等 c、可塑性：横向分化 特化细胞specialized cells： 具有特定形态结构、分子标记和功能，不能进行分化。,横向分化： 通常情况下，供体的干细胞在受体中分化为与其组织来源一致的细胞。部分干细胞在特定条件下可以转化为其它
6、胚层来源的细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞等。,1999年Goodell等人分离出小鼠的肌肉干细胞，体外培养5天后，与少量的骨髓间质细胞一起移植入接受致死量辐射的小鼠中，结果发现肌肉干细胞会分化为各种血细胞。,ESC和成体干细胞的异同,相同点：都具有干细胞的自我复制和分化能力，都有“归巢”现象。,干细胞是一类能够进行自我更新和具有分化潜能的细胞 （具有分裂增殖能力，干细胞本身不是处于分化途径的终 端）。 干细胞通过两种方式生长 *对称分裂-形成两个相同的干细胞 *不对称分裂-由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分 配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为 功能专一的分化细胞
7、；另一个保持亲代的特征，仍 作为干细胞保留下来。,干细胞的共同特征,干细胞增殖的缓慢性 干细胞增殖的自稳性,研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于许多疾病的治疗，像帕金森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是干细胞的这种潜在的价值引起了各国学者的研究兴趣。,干细胞的应用,胚胎干细胞embryonic stem cells 干细胞相关技术：克隆clone 转基因技术transgenic technology 成体干细胞：神经干细胞neural stem cells 肺干细胞pulmonary stem cells 诱导型多能干细胞induced pl
8、uripotent stem cell,主 要 内 容,胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）是从早期胚胎的 内细胞团中分离出来的一种高度未分化、具有多向分化潜能的细胞。 1981年Evans等从囊胚的内细胞群中成功分离、建立了小鼠的ESC系 1998年Thomson和Gearhart分别用胚泡内细胞团细胞和原始生殖细胞成功地建立了人的ESC系 在全球范围内掀起了ESC的研究热潮。,胚胎干细胞,ESC的体外培养建系 定向诱导分化 在生物医学上的应用,早期小鼠胚胎的获得： 受精后第4天上午，取出孕子宫，将输卵管端夹闭，由阴道端插入5号针头注入冲胚液，至宫腔达到一定压力，突
9、然松开输卵管侧，即可获得发育至囊胚期的早期胚胎。选取发育良好的囊胚接种在饲养层细胞上。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,子宫,小鼠早期胚胎的体外培养-饲养层： 饲养层细胞的作用： 培养的鼠胚成纤维细胞经丝裂霉素C处理后，可用作饲养层细胞。 饲养层细胞经丝裂霉素C处理后，虽然失去分裂能力，但仍然保持生存活性，并为胚胎干细胞的存活、增殖和未分化状态的维持提供一些必需因子，还可去除培养环境中的毒素和代谢抑制因子。 饲养层细胞的处理方法如下： 取P12-16的孕鼠，剖腹取胚胎，去除头、四肢、内脏后，Hanks液反复冲洗，剪碎鼠胚组织，胰酶消化成单细胞悬液，接种，即为原代培养鼠胚成纤维细胞。将原培
10、养液弃去，加入含10g/ml丝裂霉素C的培养液作用2-4h，然后胰酶消化制成单细胞悬液，接种在四孔板中备用。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,小鼠早期胚胎的体外培养：,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,ESC的分离培养： 待小鼠囊胚贴壁，并从透明带中孵出后，在显微操作仪下分离内细胞团，吸出内细胞团，用胰酶消化，将其离散成小的细胞团块，接种于新的铺有饲养层细胞的四孔板中。一周后即可出现ESC集落。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,ESC的分离培养-饲养层： ESC体外培养的条件非常严格，为了维持ESC的未分化状态， 在体外培养过程中，必须有饲养层或其它分化抑制剂的支持， 适宜的饲
11、养层培养体系是ESC体外培养扩增的一个关键环节。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,原代鼠胚成纤维细胞（primary mouse embryonic fibroblast， PMEF）以其易于取材、分化抑制效果好等特点而被广泛应用。 目前常用的饲养层有：STO（SIM小鼠成纤维细胞株，并为抗硫 代鸟嘌呤6-thioguanine和鸟本箭毒素甙鸟巴因oualiain选择过的 细胞）、PMEF(原代培养鼠胚成纤维细胞)、SNL(G418R基因和 LIF基因转染的STO）、HBC-5637等。 随着对人ESC研究的深入，来源于人ESC的组织器官可望用于 临床。在体外培养人ESC时多使用PMEF
12、作为饲养层，这样在 ESC用于临床治疗时，可能带来鼠源性蛋白的污染而引起不良 反应，所以有人尝试利用人胚胎成纤维细胞作饲养层进行人 ESC的培养，并已有成功的报道。,饲养层细胞的抑分化功能来源于基质中的白血病抑制因子（leukemia inhibiting factor, LIF），LIF最早于1988年在小鼠Krebs腹水瘤细胞条件培养基中被纯化的，是一种典型的多功能细胞因子。如：抑制骨髓白血病 m1细胞的增殖，诱导其向巨噬细胞方向分化；促进外周胆碱能神经分化和功能成熟；刺激破骨细胞增殖；调节肝细胞急性期反应蛋白的合成；抑制多能胚胎干细胞的分化等。 有学者向ESC培养基中加入LIF以取代饲养
13、层细胞，辅以条件培养基即可维持ESC的多能性，从而消除饲养层细胞的干扰。,ESC的纯化： 待四孔板内长满ESC集落，未出现分化 征象之前，用玻璃针挑取ESC集落，用 胰酶消化，反复吹打离散后重新接种。 集落呈克隆状生长，与饲养层细胞之间 有明显的界限，细胞排列紧密，界限不 清，可见折光性比较强的分裂相。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,ESC特异性表面标记,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,ESC的鉴定-嵌合体制备技术： 嵌合体（chimera）是指由两种或两种以上不同遗传构成的细胞 构成的个体，这种个体的组织器官由基因型不同的细胞群组成。ESC能广泛参与宿主各组织的形成，尤其是生殖
14、系的形成，成 为嵌合体制备的最佳实验材料。 嵌合体的成功制备也是证明ESC具有发育全能性的一个金指标。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,嵌合体动物的制备方法主要有三种：融合法、显微注射法和共培养法。,融合法 是指将来源于不同品系动物的早胚消化去透明带后，在融合剂（多用植物血球凝集素）的作用下，形成融合胚。实验过程中，由于消化剂、融合剂的使用，会对胚胎造成不同程度的损伤，所以融合法制备嵌合胚的成功率较低。,共培养法 是将着床前的早期胚胎与ESC进行共培养而获得嵌合胚的一种方法。虽然有资料表明，粘附在早期胚胎滋养层外面的ESC，经过过夜培养，能有效的与宿主ICM细胞整合，但是在共培养过程中，
15、很难控制发生整合的ESC的数目，因此也限制了其使用。,显微注射法 应用最为广泛。通过显微注射法构建嵌合体是一项复杂的技术，ESC本身的特性、受体胚胎的品系来源以及显微注射的熟练程度等都会直接影响嵌合体的获得。,第一部分,C57BL/6J inbred mice,KM outbred mice,ES cell culture,Singlecell suspension,5-10 ESC,micromanipulator,reimplantation,chimeras,pseudopregnant foster mother(KM),ESC的鉴定-嵌合体制备技术的应用： 目前，嵌合体制备技术已广泛应用于发育生物学、神经生物学、 遗传学、肿瘤学、毒理学等众多研究领域，在当今生物医学研 究中发挥着愈来愈重要的作用。 在制备嵌合体之前，可以对ESC进行基因操作，获取一些优良 性状，利用基因操作成功的ESC进行嵌合体的制备，如果出现 生殖系嵌合，就可以把优良性状遗传下去。在家畜品种改良方 面有广泛的应用。,从小鼠囊胚的内细胞群中分离培养ESC,人胚胎着床前的发育过程：,从人囊胚的内细胞群中分离培养ESC,ESC的诱导分化： 细胞分化cell differentiation：在个体发育中，由一种相同的细胞 类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异， 产生各不相同的细胞
