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1、实习内容四 植物病原物的分离,病原菌通常是与其它微生物混生在一起的，从病组织中将病原菌单独分选出来，称为分离。 分离出的病原物在人工培养基上生长，称为培养。,一、实验目的,通过实验了解和认识各种植物病原物的分离和培养方法，学会常用的植物病原物的分离和培养技术。,（一）材料 选择新近发病的植株、器官组织作为分离材料，并在病、健交接处选材取样，可以减少腐生菌的污染。,二、材料与仪器,（二）仪器 酒精灯、酒精缸、酒精、火柴、接种针（环）、镊子、解剖刀、刀片、剪刀，灭菌水、0.1%升汞、灭菌培养皿，灭菌水、灭菌培养基、记号笔等。,二、材料与仪器,(三) 内容与方法,分离材料的选择对分离培养的成败有着决
2、定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。,病原菌分离的方法因材料不同而异，植 病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种： 1. 稀释分离法： 适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离。,以大白菜软腐病为例： 大白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次接种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下衬以
3、吸水纸保湿。用无菌解剖刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，在2025下培养，经1天左右呈现腐烂，如此反复接种几次，至病斑纯净为止。,分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭菌培养皿3副，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用移置环移取菌悬液一环，放在第1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀释液至第2皿，再以同法稀释成第3皿。,取熔化后冷至45左右的(一般将化好的培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度)牛肉膏蛋白胨培养基，每皿倒约15毫升，沿着桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于2628的温箱中培养。,12日后可见白色，圆形或近圆形直径为12毫米的菌落，从中选典型菌落用移植环（划线法）移入牛肉膏
4、蛋白胨斜面培养基上培养，每组转45管，注意过早出现的大型菌落多为腐生细菌。,以上分离实验也可以划线法进行，方法是先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，制成平板。,然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，在第一个培养皿平面培养基的左方长方形区内划平行线57条，再以此移置环继续向右(和左方小区内的几条平行线成一定角度)划57条平行线，依此法划两皿，倒置于2628温箱中培养，12日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，培养待用。,2. 组织分离法： 这种方法适用于大部分病菌的分离，以玉米大斑病为例： 取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取23毫米长的病组织，在70%的
5、酒精中浸23秒种，目的是在表面消毒的同时，驱除病组织表面的气泡，使病组织与升汞溶液能够充分接触发挥消毒作用。,按无菌操作法将病组织移入0.1%升汞溶液中表面消毒 35分钟，时间长短依病组织不同而异。然后在无菌水中连续漂洗3次，除去残留的消毒剂后，直接移至PDA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，每皿放45块，倒置于2025室温下，一般34天后观察待分离菌生长结果。,待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA斜面培养基上，在25温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，若仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。,分离工作应在无菌条件下进行，无菌室和超净工作台是分离不可缺少的设施。,若限于条件，实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，分离开始前准备好一切用品，避免工作过程中频繁走动，破坏环境带来杂菌，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。,
