流式细胞仪工作原理

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1、流式細胞儀工作原理劉 益 年 產品應用專員 美商必帝股份有限公司 E mail: kenny_FACSCalibur大綱 實驗設計原理 流式細胞儀運作原 理 FACSCalibur 操作流程Introduction of the experiment design for Flow Cytometry 藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性 藉由螢光化合物標識細胞特性 藉由螢光染劑標識細胞特性 藉由螢光蛋白標識細胞特性 Cytometry Beads Array單一細胞特性之偵測單一細胞特性之偵測Adhesion Receptors Metaboliccytokinesstructure enzyme

2、s7Lysed Whole Blood ComponentsGranulocytesGranulocytesMonocytesMonocytesEosinophilsEosinophilsBasophilsBasophilsNeutrophilsNeutrophilsLymphocytesLymphocytesT TB BNKNKT T HelperHelperT TCytotoxicCytotoxicPeripheral White Blood CellsPeripheral White Blood Cells CD45+CD45+CD3CD3+ +CD4CD4+ +CD3CD3+ +CD8

3、CD8+ +CD3CD3+ +CD3CD3- -CD19CD19+ +HLA-DRHLA-DR+ +CD3CD3- -CD16CD16+ +CD56CD56+ +MonocytesMonocytes8Example訊息傳導BD PhosFlow for Whole Blood or PBMC Sampleshttp:/Mapping normal and cancer cell signalling networks: towards single-cell proteomics. Nat Rev Cancer. 2006 Feb;6(2):146-55 Development Of Visu

4、alization ToolsNolan et al.Irish JM, Hovland R, Krutzik PO, Perez OD, Bruserud O, Gjertsen BT, Nolan GP. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 2004 Jul 23;118(2):217-28.Clustering of Biosignature, Clinical Significance實驗設計原理 藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性 藉由螢光化合物標識細胞特

5、性 藉由螢光染劑標識細胞特性 藉由螢光蛋白標識細胞特性 Cytometry Beads ArrayAnnexin V AssayFlow Cytometric Analysis of Apoptosis in Jurkat T CellsRelative Cell NumberAnnexin VPE0 0.5 1 2 4Incubation with Camptothecin (hr)Fas-induced Apoptosis in Jurkat CellsPIAnnexin V-FITC實驗設計原理 藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性 藉由螢光化合物標識細胞特性 藉由螢光染劑標識細胞特性 藉由螢

6、光蛋白標識細胞特性 Cytometry Beads ArrayDNA 特異性染劑N+C2H5NH2NH2EthidiumN+C2H2)3NH2NH2N+C2H5CH3C2H5PropidiumGG2 2MMGG0 0GG1 1 s s0 200 400 600 8001000GG0 0GG1 1s sGG2 2MMDNA contentC o u n t2N2N4N4N細胞周期位相的決定Sub G1細胞增殖反應細胞增殖反應實驗設計原理 藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性 藉由螢光化合物標識細胞特性 藉由螢光染劑標識細胞特性 藉由螢光蛋白標識細胞特性 Cytometry Beads ArrayGFP

7、 as ReporterGFP as a ReporterGFP as a Reporter The Usage of GFPGervaix, A. et. al. 1997. A new reporter cell line to monitor HIV infection and drug susceptibility in vitro. PNAS vol. 94.GFP as a ReporterGFP as a Reporter實驗設計原理 藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性 藉由螢光化合物標識細胞特性 藉由螢光染劑標識細胞特性 藉由螢光蛋白標識細胞特性 Cytometry Beads A

8、rrayCytometric Beads Array (CBA)Single Step Incubation Two-Step Incubation or Beads Provide a Flexible PlatformMultiple sizesBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometerDifferent intensities*Different colors with different intensitiesProteins MeasuredA. Interleukin (IL)-2

9、B. IL-4C. IL-5D. IL-10E. Tumor Necrosis Factor-aF. Interferon-gZap 70 Detection.Kinetic analysis of T cell activation by anti-CD3/CD28Philadelphia chromosome The presence of this translocation is a highly sensitive test for CML, since 95% of people with CML have this abnormality Philadelphia chromos

10、ome緩衝液 液流區緩衝液 液流區樣品流動區偵測區激發光源-螢光 -散射光 流式細胞儀的工作原理流式細胞儀能測量 : 散射光 細胞大小 (前方散射光) 細胞折射率 (側方散射光) 各色螢光液流系統:將細胞依序送到測量區受檢。 光學系統:產生並收集螢光、光散射等信號。 電子系統: 將光學訊號轉換成電子訊號。 分析所輸出的電流訊號，以脈衝高度、寬度、積 分面積顯示。 量化訊號並傳至電腦。 綜合三個系統的功能:綜合三個系統的功能-液流系統FACS Calibur 的液流系統FACS Calibur 儀表板LO = 12uL/min MED = 35uL/min HI = 60uL/minPRIME=

11、 Drain & FillSTANDBYRUNred laser blue laserLow Sample PressureHigh Sample Pressuresheathsheath samplesheathsheathsample綜合三個系統的功能-光學系統螢光濾片FACS Calibur 的光學系統488 nm綜合三個系統的功能-電子系統將光學訊號轉換成正比例的電子訊號。 分析所輸出的電子訊號，以脈衝高度、 寬度、積分面積顯示。 將量化訊號傳至電腦。 電子系統電子系統電位脈衝之定量訊號之產生與處理Amp Gain 1.0-9.99The Use of Linear Amplifica

12、tonAssume we convert linear analog signals using a 10 bit ADC- -we have 1024 channels of range corresponding to 0-10 V. Channel difference is 10V/1024= 0.01VIdeal Lin To Log Conversion實驗數據的呈現15 to 20 mmMonocyte 10 to 14 mmNeutrophil8 to 10 mm Lymphocyte散點圖反映細胞形態常見的數據呈現直方圖分析報告 CV=S.D./Mean散點圖分析報告 FAC

13、SCalibur-複習綜合三個系統的功能儀器之調試 調整FSC / SSC 散點圖以圈選目標細胞 群 設閾參數及閾值 調整螢光信號接受器 FL 1-4 色差補償 儀器之調試 調整FSC / SSC 散點圖以圈選目標細胞 群 設閾參數及閾值 調整螢光信號接受器 FL 1-4 色差補償 散射光信號的調整散射光信號的調整散射光信號的調整 Cell Line儀器之調試 調整FSC / SSC 散點圖以圈選目標細胞 群 設閾參數及閾值 調整螢光信號接受器 FL 1-4 色差補償 閾值的調整儀器之調試 設閾參數及閾值 調整FSC / SSC 散點圖以圈選目標細胞 群 調整螢光信號接受器 FL 1-4 色差

14、補償 自體螢光信號的調整 Single儀器之調試 設閾參數及閾值 調整FSC / SSC 散點圖以圈選目標細胞 群 調整螢光信號接受器 FL 1-4 色差補償 Remember the basic assumption of flow analysis:The signal in FL1= the signal from FITC and only FITC andthe signal in FL2= the signal from PE and only PE.This is NOT TRUE for the raw data!The process by which each fluore

15、scence channel is “corrected” for this spectral overlap is termed Fluorescence CompensationFL1 = FITC + x% PEFL2 = PE + y% FITC螢光補償調整 (The Problem)螢光補償調節FL2 - %FL1FL-1(FITC)FL-2(PE)FL1 - %FL2(18 30%)(0 1%)螢光補償調節(Compensation Fitc)螢光補償調節(Compensation Pe1)螢光補償調節(Compensation Pe2)螢光補償調節(Compensation Pe

16、rCP)FACSCalibur 各部構造 檢體吸取區(SIP)Droplet Containment System包含 ：a. 外管 b. 真空幫浦 清除內管內前一個檢體殘留物 c. 上樣管(內管)內管(SIT)底座Bal sealFACSCalibur儀表板LO = 12uL/min MED = 35uL/min HI = 60uL/minPRIME= Drain & FillSTANDBYRUN正確開機程序1. 開啟細胞儀電源。2. 開啟其他周邊配備電源，如印表機及 M. O.。3. 開啟電腦。4. 確認鞘流液筒有八分滿的 FACS FLOW，旋緊。5. 將廢液倒掉，並在廢液筒中加入100 c.c. 家用漂 白水。6. 將氣壓閥方向調在加壓（Pr