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1、1细 胞 破 碎2生物分离过程的一般流程本章内容3常见的细胞壁结构细胞破碎技术包涵体的纯化方法本章的主要内容4概述不同类型的细胞分泌目标产物的类型：l动物细胞多分泌到细胞外培养液l植物细胞多为胞内产物l微生物（细菌/酵母/真菌）胞内、胞外对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行 破碎。 5概述(大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。(有些目标产物存在于生物体中。l尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是 在细胞内沉积。 l脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。6概 述细胞破碎（cell rupture）技术是指利用外力破 坏细胞膜和细胞壁，使细胞内物质包括目的产 物
2、成分释放出来的技术。细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌 型生化物质（产品）的基础。为了研究细胞破碎，提高其破碎率，有必要了 解各种微生物细胞壁的组成和结构。715.1 细胞壁结构对破碎的影响Z微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞 壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有 细胞膜。Z通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压 冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于 细胞壁。Z不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞 壁的机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就 不同。8细菌细胞壁结构Z 几乎所有细菌的细胞壁都是 由肽聚糖组成，它是难溶性 的聚糖链；Z 相邻聚糖链上的短肽又交叉 相联，构成了
3、细胞壁的三维 网状结构，包围在细胞周围 ；Z 使细胞具有一定的形状和强 度。9细菌细胞壁结构u破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构， 其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在 的肽键的数量和其交联的程度。u革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大 不同。 u革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细 胞生产了很多细胞重组的产物。药物名称宿主用途胰岛素大肠杆菌治疗糖尿病 人生长激素大肠杆菌治疗侏儒病-干扰素大肠杆菌治疗毛状细胞白血病等10酵母细胞壁的结构示意图u最里层是由葡聚糖的细纤维 组成，它构成了细胞壁的刚 性骨架，使细胞具有一定的 形状，u上面的是一层糖蛋白，u最外层是甘露
4、聚糖，由1,6- 磷酸二酯键连接成网状。在 该层的内部，有甘露聚糖- 酶的复合物。u破碎酵母细胞壁的阻力主要 决定于壁结构交联的紧密程 度和它的厚度。11真菌的细胞壁l真菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次 还含有较少量的蛋白质和脂类。l不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同， 其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚 糖构成，少数含纤维素。l与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的 强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此， 它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所 以强度有所提高。12l红面包霉菌细胞壁具有同心圆层 状结构主要存在三种聚合物l最外层(a)是-和-葡聚糖的 混合物，l第2层(b)是糖蛋白
5、的网状结构l第3层(c)主要是蛋白质，l最内层(d)主要是几丁质。红面包霉菌细胞壁的结构示意图13微生 物革兰氏 阳性细菌革兰氏 阴性细菌酵母菌霉菌壁厚20-80 nm10-13 nm100-300nm100-250nm 层次单层多层多层多层 主要 组成肽聚糖(40-90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(11-22%) 磷脂 蛋白质葡聚糖(30- 40%) 甘露聚糖(30%) 蛋白质(6-8%) 脂类(8.5- 13.5%)多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质细胞壁的组成和结构微生 物革兰氏 阳性细菌革兰氏 阴性细菌酵母菌真菌壁厚20-80
6、 nm10-13 nm100-300nm100-250nm 层次单层多层多层多层 主要 组成肽聚糖(40-90%) 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖(1-4%)肽聚糖 (5-10%) 脂蛋白 脂多糖(11-22%) 磷脂 蛋白质葡聚糖(30- 40%) 甘露聚糖(30%) 蛋白质(6-8%) 脂类(8.5- 13.5%)多聚糖 (80-90%) 脂类 蛋白质细胞壁的组成和结构14植物细胞壁的结构l对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生 壁两部分。l初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1 3m），富有弹性。l由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半 纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D
7、-葡聚糖，许 多这样的长链形成微纤丝。l它是构成细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来 自于微纤丝。15植物次生细胞壁某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生 细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚 (4m以上)，常有三层组成。n在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增 加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则 ，而且存在木质素的沉积。因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性， 使植物细胞具有很高的机械强度。16研 磨15.2 细胞破碎技术17机械破碎捣碎法 研磨法 匀浆法 超声法 物理破碎温度差破碎法 压力差破碎法化学破碎有机溶剂： 表面活性剂： 酸碱酶促破碎自溶法 外加酶制剂法通过机械
8、运动产生的剪切 力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用， 使组织、细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞 膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理18一 机械法机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization） 高速珠研磨破碎法（bead grinding） 超声波破碎法（ultrasonication）19采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成）。1.高压匀浆法 （High-pressure homogenization）细胞悬浮液自高压室针 形阀喷出时，每秒速度
9、高达几百米，高速喷出 的浆液又射到静止的撞 击环上，被迫改变方向 从出口管流出。细胞在 这一系列高速运动过程 中经历了高速剪切、碰 撞及压力骤降，造成细 胞破碎。2021高压匀浆器的种类高压匀浆器的种类较多：pWAB公司的AVP Gaulin 31MR型pBran and luebbe 公司SHL40型p意大利Niro Soavi高压匀浆机22高压匀浆法使用时注意事项u高压匀浆器的操作温度上升约-/10MPa 为了控制温度的升高，可在进口处用干冰调节 温度，使出口温度调节在20左右。u可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方 式。u在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎 的及浓度高或处于生长
10、静止期的细胞，常采用 多次循环的操作方法。23高压匀浆法适用的范围大规模细胞破碎的常用方法 高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。 不宜使用高压匀浆法。易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性菌，含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀 浆阀）24影响高压匀浆器细胞破碎因素被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=KNP (15-1) 式中 R 破碎率，为N次循环后，蛋白 质的释放量Rn与最大释放量Rm之比；K 与温度有关的速度常数；P 操作压力，MPa； 与微生物种类有关的常数。25l升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至
11、一次通过匀浆阀就可达到几 乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但p大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明p 超生一定值时，R增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为5570Mpa。l破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基 上容易破碎。影响高压匀浆器细胞破碎因素26高压匀浆法-X-挤压器l改进的高压方法：将浓缩的菌体悬液冷却至- 25至-30形成冰晶体，利用500MPa以上的 高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。l细胞破碎是由于冰晶体在受压时的相变，包埋 在冰中的细胞变形所引起的。l主要用
12、于实验室中。l优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的 粉碎程度低以及活性的保留率高l对冷冻一融解敏感的生化物质不适用。272）珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u细胞悬浮液与极细的玻璃小 珠、石英砂、氧化铝等研磨 剂（直径小于1mm）一起快速 搅拌或研磨，研磨剂、珠子 与细胞之间的互相剪切、碰 撞，使细胞破碎，释放出内 含物。u在工业规模的破碎中，常采 用高速珠磨机WSK卧式高效全能珠磨机28高速珠磨机工作原理l磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器 高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动；l细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起l在出口处，旋转园盘和出口平 板之间的
13、狭缝很小，可阻挡玻 离小珠，使不被料液带出。l由于操作过程中会产生热量， 故磨室还装有冷却夹套，以冷 却细胞悬浮液和玻离小珠。29Netzsch LM-20型珠磨机A-具有冷却夹套的圆筒形磨室B-具有冷却装置的搅拌轴和圆盘C-环形震动侠缝分离器D-变速马达1和2料液进出口3和4 搅拌冷却剂进出口5和6磨室冷却剂进出口l园盘以两种位置交错地安装在轴上，l一种处于径向，一种与轴倾斜，l径向盘使磨料沿径向运动，倾斜盘则产生轴向运动。l由于交错的运动，提高了破碎效率。30珠磨机破碎作用方程u破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程， 符合下列公式：ln1/(1-R)=Kt 15-2 uR 破碎率；K一
14、一级反应速度常数；t一 时间。uK与搅拌转速、细胞悬浮液浓度和循环速度、玻璃小珠 装量和珠体直径，以及温度等相关。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分 子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不 易分离而给后续操作带来的困难。313）超声波破碎l超声波破碎法（Ultrasonication)利用超声波 振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞 悬浮液。l超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介 质两种型式，一般破碎效果后者比前者好。l超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超 声波的声频、声能有关。32超声波破碎的机理JY92-II D超声波细细胞粉碎机(一般
15、认为在超声波作用下液体发生空化作用（ cavitation),(液体中局部空穴的形成、增大和闭合产生极大 的冲击波和剪切力，引起的粘滞性旋涡在细胞 上造成了剪切力，使细胞内液体发生流动，从 而使细胞破碎。(操作过程产生大量的热，因此操作需在冰水或 外部冷却的容器中进行。33超声波破碎的适用范围超声波破碎是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破 碎，对酵母菌的效果较差。但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性 活性物质失活。超声波破碎的有效能量利用率极低由于对冷却的要求相当苛刻，所以不易放大， 但在实验室小规模细胞破碎中常用在实验室小规模细胞破碎
16、中常用。34技术原理效果 成本举例匀浆法( 孔型)须使细胞通过的小 孔，使细胞受到剪 切力而破碎剧烈 适中细胞悬浮液大规模 处理珠磨破碎 法细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎剧烈 便宜细胞悬浮液和植物 细胞的大规模处理超声波法用超声波的空穴作 用使细胞破碎适中 昂贵细胞悬浮液小规模 处理 研磨法细胞被研磨物磨碎适中 便宜匀浆法( 片型)细胞被搅拌器劈碎适中 适中动物组织及动物细 胞不同机械破碎方法的比较35非机械破碎方法酶溶破碎法（enzyme lysis） 化学破碎法（chemical treatment） 去垢剂破碎法（detergents） 渗透压冲击破碎法（osmotic shock） 冻融破碎法（freezing and thawing）36二 非机械法非机械方法很多 1 酶解 2 化学法溶胞 3 物理法n渗透压冲击n冻结和融化n干燥法 其中酶法和化学法溶胞应用最广。二371 酶解
