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1、溴甲酚绿法测定血清清蛋白及 批内重复性试验浙江中医药大学生命科学学院生物化学教研室引言：清蛋白是血清内含量最多的一种蛋白质，以前用硫 酸铵盐析法沉淀球蛋白，再用总蛋白测定方法测定上清液 中的清蛋白。目前测定清蛋白的方法有电泳法、免疫法和 染料结合法，以染料结合法最常用。清蛋白具有与阴离子 染料溴甲酚绿(BCG)和溴甲酚紫(BCP)结合的特性，而球 蛋白基本不结合这些染料，故可直接测定血清清蛋白。 BCG法和BCP法灵敏度高、操作简便、重复性好，能自动 化。其中BCG法最常用，虽然和球蛋白与BCG也能起 慢反应，但缩短反应时间即能去除此非特异性反应。 【实验目的】掌握： 1、溴甲酚绿法测定血清清
2、蛋白的基本原理 。2、学习方法学评价之一批内重复性试验。熟悉：1、 血清清蛋白测定的临床意义。2、 批内重复性试验测定意义。了解：溴甲酚绿法测定血清清蛋白的特点和注 意事项 。【实验原理】1血清清蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染 料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物，在波长 600nm处有吸收峰，其颜色深浅与清蛋白浓度成正比例，与同样处理的清蛋白标准比较，可求得 血清中清蛋白含量。2批内重复性试验是指在相同条件下（用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同 一个实验室由同一个人操作，并保证实验期间准 确度不变）对同一标本在尽可能短的时间内平行
3、 测定20次(由于试剂原因，本次实验做12次），以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映 各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价本 法测血清（浆）清蛋白随机误差的大小。【试剂与器材】 1.工作试剂：琥珀酸缓冲液、溴甲酚绿BCG、表 面活性剂-聚氧化乙烯月桂醚、防腐剂-叠氮钠 2.清蛋白标准液 可自行配制：如称取牛血 清白蛋白4g、叠氮钠50mg，溶于蒸馏水中并缓慢 搅拌助溶，配成100mL，密封贮存于4冰箱，可 稳定半年。也可用定值参考血清清蛋白标准。 3.测定样品：人血清或其他待测样品。 4.仪器 ：漩涡混合器、分光光度计（可购商品试剂或自配 ）【操作步骤】1.手工操作法 取试管14支
4、，按下表操作。BCG法测定清蛋白操作步骤：(ml)加入物 空白管 标准管 测定管（1） （2）（3）（4）- 待测样本 - - 0.01 0.01 0.01 0.01标准液 - 0.01 - - - -蒸馏水 0.01 - - - - -BCG试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.037孵育10分钟后，在波长600nm处用空白管调零，读取 吸光度。2. 如标本因严重高脂血症而混浊，需加做标本空白 管：取血清0.01ml，加入BCG空白试剂3.0ml，在 波长600nm处用BCG空白试剂调零，测定标本空 白管吸光度。用测定管吸光度减去标本空白管吸 光度后，再计算结果。.如同时用双缩脲
5、法测定血清标本中总蛋白浓度， 减去血清清蛋白浓度即为球蛋白浓度，并可求得血清 清蛋白、球蛋白比值(AG比值)。注意：同一样本有十二个测定结果，先计算蛋白质含 量，再进行变异系数的计算。血清清蛋白=(g/L)测定管吸光度标准管吸光度清蛋白标准浓度(g/L) 【浓度计算】【变异系数（CV%）值计算】v检验12次测定数据中的离群值，如存在异常值应剔除 。对小样本量的测定，可以用Grubbs检验，其统计学 公式是：Xd为离群值； 、 s分别为包括离群值在内的均值 、标准差，如果计算的G值大于系数表(表32)中相应 显著水平的“和测定次数12时的临界值Ga.n，则将Xd作为异常值舍弃，可按下述三种情况来
6、处理： G=xd- s(1) 只有一个离群值的情况：设有n个测定数(XlX2X3 X4Xn)，其中X1为离群值，即可利用上述公式， 直接对Xl进行检验。如：33，42，43，42.5，42.3， 43.5 (2) 如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数X的同一 侧，例如X1、X2都是离群值，则首先检验最内侧的一个 数据(X2)，即通过检验G2来决定X2是否应该舍弃。如果 X2应该舍弃，X1自然应该舍弃。如果X2不应舍去，则再 检验X1。如：32，32.5， 42，43，42.5，42.3，43.5 ，先检测 32.5是否是离群值。(3) 如果离群值有两个或两个以上,而且又分布于均数两侧,例
7、 如X1和Xn都同属于离群值,则分别检验X1和Xn是否应该舍 去.如有一个数据决定舍去,那么再检验另一个数据时,测定 次数应该作为减少一次来处理,而且此时应该选择99%的置 信水平。2.剔除离群值后，再计算均值、标准差和变异系数。（1）批内标准差（S）=（2）变异系数（CV%）=批内标准差（S）批内均数100%【参考范围】 1. 正常成人为3448g/L。 2. CV%批内应小于等于2.0%【血清清蛋白测定的临床意义】v 血清清蛋白浓度增高 常见于严重脱水所致的血浆浓缩。 v 血清清蛋白浓度降低 在临床上比较重要和常见，通常与 总蛋白降低的原因大致相同。急性降低主要见于大出血和 严重烧伤；慢性
8、降低见于肾病蛋白尿、肝功能受损、肠道 肿瘤及结核病伴慢性出血、营养不良和恶性肿瘤等。血清 清蛋白低于20g/L，临床上出现水肿。 vAG比值 某些病人（如重症肝硬变有腹水者）可同时出 现清蛋白减少和球蛋白升高的现象，严重者AG比值 1.0，这种情况称为AG比值倒置。 v文献报导还有极少见的因清蛋白合成障碍，血清中几乎没 有清蛋白的先天性清蛋白缺乏症 。批内重复性试验测定意义批内重复性试验能反映各次测定结果相 互接近的程度，用于客观评价这种测定方法 随机误差的大小【注意事项】1. BCG是一种pH指示剂，变色域为pH3.8(显黄色) 5.4(显蓝绿色)，因此控制反应液的pH是本法测定的关键。2.
9、 配制BCG试剂也可用其他缓冲液如枸櫞酸盐或乳酸盐 缓冲液。但琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通过原点，线性好， 灵敏度高，成为首选推荐配方。3. 试剂中的Brij-35也可用其他表面活性剂代替，如吐温- 20或吐温-80，终浓度为2mlL，灵敏度和线性范围不变。4. 当60gL的清蛋白标准液与BCG结合后，溶液光径 1.0ml，在630nm处测定的吸光度应为0.811土0.035，如 达不到此值，表示灵敏度较差。5. 蛋白质标准是一个复杂问题。实验证明，BCG不但与清 蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以a1 -球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较 清蛋白稍慢。由于在30s
10、内呈色对清蛋白特异，故BCG与 血清混合后，在30s读取吸光度，可明显减少非特异性呈 色反应。为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清 作标淮。【评价】v本法操作简便、快速，胆红素、溶血和中度脂血症无干扰 ，既可手工操作，也能自动化分析，是目前国内测定血清 清蛋白的最常用方法。v本法线性范围为1060g/L，RCV4。但该法与溴甲酚 紫法比较，对血清清蛋白特异性稍差。【思考题】v简述溴甲酚绿法测定血清清蛋白的基本原理。v简述血清清蛋白测定的临床意义。v可用于建立蛋白质测定方法的蛋白质特性有哪些? 经典和常用方法有哪些?（P95）v什么是批内重复性试验，它的测定意义是什么？v1.简述溴甲酚绿法
11、测定血清蛋白的基本原理？v 答：血清蛋白在PH4.2的缓冲液中带正电荷，在由非离子型表面活性剂存在时，可与带 负电荷的燃料溴甲酚绿结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅 与清蛋白的浓度成正比例，与同样处理的清蛋白标准比较，可求得血清中清蛋白的含量 。v2.简述血清蛋白测定的临时意义？v答血清清蛋白浓度增多：常见于严重脱水所致的血浆浓缩。v 血清清蛋白浓度降低：在临床上比较重要和常见，通常与总蛋白降低见于肾病蛋白 尿.肝功能受损.肠道肿瘤及结核病伴慢性出血，营养不良和恶性肿瘤等。血清清蛋白低 于20g/L,临床上出现水肿。v A/G比值：某些病人可同时出现清蛋白减少和球蛋白
12、开交的现象，严重者A/G比值 1.0，这种情况称为A/G比值倒置。v 文献报导还有极少见的因清蛋白合成障碍，血清中几乎没有清蛋白的先天性清蛋白 缺乏症。v3.可用于建立蛋白质测定方法的蛋白质特性由哪些？经典和常用方法由哪些？v 答：特性：如重复的肽链结构;酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外线的吸收;与色 素结合的能力；沉淀后的浊度；电泳的迁移率大小等。v经典和常用方法：凯式定氨法 双缩脲法 酚试剂法紫外分光光度法 染料结 合法 化学比浊法 全自动电泳仪v4.什么是批内重复试验？它的测定意义是什么？v答：批内重复性是将同一材料分成数份实际标本，在比较短的时间内进行多次分析测定 （一般为20次），从而获得批内精密度数据，可以反映测定方法随机误差的大小。v
